实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

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1、·1236·中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12中国图书分类号Q789文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1236-05【实验技术】实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数宣姚吉周祥山张元兴【摘要】目的建立实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR反应，建立标准曲线。将含有外源GFP基因的毕赤酵母基因组进行实时荧光定量PCR，通过标准曲

2、线计算出外源GFP基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。结果毕赤酵母GAP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为：y=-3.612x+39.28，GFP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为：y=-3.544x+37.99，GAP基因和GFP基因的反应效率分别为0.89和0.90，两条标准曲线的相关系数均为0.999，且均有良好的重复性。检测10个转入GFP基因的毕赤酵母菌株，筛选到9个单拷贝整合GFP基因的菌株和1个多拷贝整合GFP基因的菌株。结论已建立了检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR法，该方法能够筛选出不同外源基因拷贝数的毕赤酵母菌株。【关键词】实时荧光定

3、量PCR；毕赤酵母；基因拷贝数DeterminationofCopyNumberofForeignGeneinGenomeofPichiapastorisbyReal-timeFluorescentQuantitativePCRXUANYao-ji,ZHOUXiang-shan,ZHANGYuan-xing（StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChi－naUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China）【Abstract】ObjectiveTodevelopame

4、thodfordeterminationofthecopynumberofforeigngeneingenomeofPichiapastorisbyreal-timefluorescentquantitativePCR.MethodsThestandardcurvesofGAPandGFPgenesweregeneratedwiththeplasmidscontainingGAPandGFPgenesrespectively,andthegenomicDNAofP.pastoristransformantscontainingGFPgenewasanalyzedbyreal-t

5、imefluorescentquantitativePCR.ThecopynumberofGFPgeneineachtransformantwascalculatedwiththeCtvalueofP.pastorisgenomicDNAandthestandardcurve.ResultsTheregressionequationofCtvalueandlogarithmoforiginalcopynumberofGAPgenewasy=-3.612x+39.28,whilethatofGFPgenewasy=-3.544x+37.99.Thereactionefficien

6、ciesofGFPandGAPgeneswere0.89and0.90respectively.However,boththecorrelationcoefficientsofstandardcurvesofthetwogeneswere0.999,andboththecurvesshowedgoodreproducibility.OfthetenP.pastoristransformantstested,ninecontainedonecopyandonecontainedmultiplecopiesofGFPgene.ConclusionAreal-timefluoresc

7、entquantitativePCRmethodwassuccessfullydeveloped,whichmightbeusedforscreeningofP.pastoristransformantscontainingvariouscopiesofforeigngenes.【Keywords】Real-timefluorescentquantitativePCR;Pichiapastoris;Genecopynumber［3］在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一数。但相关文献报道较