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1、网络出版时间：2017-04-2708:08:541网络出版地址：32http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1220.S.20170427.0808.002.html大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第32卷长到一定数目时,加入IPTG诱导剂,致使其产生了太平洋鳕AFP4基因ORF的完整性和准确性。大量T7RNA聚合酶,它能特异性地识别pET-32a本研究中成功获得太平洋鳕抗冻基因AFP4的重组表达载体中的T7强启动子序列,从而使目的重组表达载体,能够有效地进行体外表达,对该重组蛋蛋白得以高效表达。同时表达载体中的硫氧还蛋白白进行纯化后
2、获得了相应的多克隆抗体,研究结果TrxA与目的基因融合表达,增加了融合蛋白的溶将为后续工作中开展AFP4功能验证,以及大规模解性,同时降低了对宿主细胞的毒害作用。在生产和应用提供了必要的基础,具有重要的参考价pET-32a表达载体的C端含有6个His标签序列,值。His标签序列较短,与其他标签载体相比,在降低对抗体特异性影响的同时还对Ni-NTA层析介质上参考文献:2+的Ni具有特异吸附能力,可以达到分离、纯化重组蛋白的目的。由于在诱导过程中蛋白极易以包涵[1]摇李金耀,马纪,张富春.抗冻蛋白研究进展(英文)[J].中国生体形式存在于沉淀中而不易纯化,本试验中通过对物化学与
3、分子生物学报,2005,21(6):717-722.[2]摇CrevelRWR,FedykJK,SpurgeonMJ.Antifreezeproteins:char鄄诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度3个条件进行优acteristics,occurrenceandhumanexposure[J].FoodandChemi鄄化,以研究在哪种条件下融合蛋白易在上清中表calToxicology,2002,40(7):899-903.达。结果表明,诱导温度为37益、IPTG浓度为[3]摇BarrettJ.Thermalhysteresisproteins[J].TheInternat
4、ionalJournal0郾01mmol/L、诱导3h条件下,融合蛋白的表达ofBiochemistry&CellBiology,2001,33(2):105-117.量最高。SDS-PAGE电泳检测表明,AFP4基因以[4]摇NelsonJS.FishesoftheWorld[M].4thed.NewJersey:JohnWi鄄可溶性形式在大肠杆菌中高效表达。ley&Sons,2006.[5]摇张强,谢锋,江建平,等.冷血脊椎动物冷适应研究[J].四川动3郾2摇融合蛋白的鉴定物,2006,25(2):433-438.[6]摇DevriesAL.Glycoproteinsa
5、sbiologicalantifreezeagentsinAnt鄄[19]关于抗冻基因的表达,张晓等对大黄鱼4arcticfishes[J].Science,1971,172(3988):1152-1155.型抗冻蛋白基因进行了原核表达及功能研究。但该[7]摇KomatsuSK,DeVriesAL,FeeneyRE.Studiesofthestructureof研究中试验对象与本研究不同,在大黄鱼类中该基freezingpoint-depressingglycoproteinsfromanAntarcticfish[J].因的开放阅读框编码124个氨基酸,本研究中,太The
6、JournalofBiologicalChemistry,1970,245(11):2909-2913.[8]摇DeVriesAL,VandenheedeJ,FeeneyRE.Primarystructureof平洋鳕AFP4基因的开放阅读框编码125个氨基freezingpoint-depressingglycoproteins[J].TheJournalofBiologi鄄[19]酸。张晓等所表达的大黄鱼4型抗冻蛋白是以calChemistry,1971,246(2):305-308.可溶性形式存在,本试验中太平洋鳕AFP4抗冻蛋[9]摇DumanJG,DevriesA
7、L.Freezingresistanceinwinterflounder白也是以可溶形式存在。张晓等在研究中所采用的Pseudopleuronectesamericanus[J].Nature,1974,247(5438):原核表达载体为pGEX-4T-1,所用感受态细胞为237-238.[19][10]摇DumanJG,DeVriesAL.Isolation,characterization,andphysicalE郾coliTOP10,与本研究中所采用的表达载体及propertiesofproteinantif
