实验4、沉淀反应(二).ppt

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1、实验四沉淀反应（二）实验内容免疫电泳单向扩散电泳一、免疫电泳原理：区带电泳后进行双相琼脂扩散实验。将待测标本置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因分子量及电泳迁移率不同，被分成肉眼不可见的若干区带。电泳结束后，沿与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散。18-24h后，各区带蛋白与相应的Ab在相应的位置上形成弧形沉淀线。Ag越多，沉淀线越靠近Ab槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组分分析，仅为定性实验。用途：定性实验，主要用于纯化Ag和Ab成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别和鉴定等方面。试剂和器材

2、：1.2%的琼脂、打孔器、小木块、小刀、直尺、加样枪及枪头、1:2人血清、抗人全血清、毛滴管、湿盒、电泳槽、电泳仪等实验方法1.浇板：吸热琼脂4ml浇板。2.打孔、挖槽（槽中琼脂暂时不取出）3.加样（Ag）：正常人血清10ul（1:2稀释）4.电泳：稳压80-100v，1h（看到电泳的位置快到槽头左右即可）。5.加样（Ab:）取出后，将槽中琼脂挖出，加入抗人全血清（不稀释）。6.置湿盒中，37度，18~24h，观察结果。+--注意事项1、开槽处距玻片边缘>5mm,开孔处>7.5mm。2、槽中加抗血清时，加满即可，切忌溢出。

3、二、单向琼脂扩散电泳原理：单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定量试验。一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适条件下，形成乳白色的沉淀环。沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。意义：单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定。试剂和器材：1.2%的琼脂、56度水浴、Ab、玻片、打孔器、直尺、加样枪及枪头、标准参考血清、待测样本、湿盒等实验方法1、制备抗体琼脂凝胶

4、板：将已知Ab加入56度保温的1.2%的琼脂中（温度不能过高，保持在56度左右），混匀。2、浇板：吸取4ML琼脂，快速浇于玻片上。3、打孔：凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。4、加样：将标准参考血清按从小到大的浓度分别加入各孔中，同时将待检血清加入待测孔中，每孔10ul。5、扩散：将琼脂板平放于湿盒内，置37℃24～28小时后观察结果。打孔方案注意事项制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性。加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。