实验4蛋白质的颜色反应和沉淀反应.ppt

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1、实验四蛋白质的颜色反应和沉淀反应目的：掌握鉴定蛋白质的原理和方法。2.原理：蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。I.蛋白质的颜色反应A.双缩脲反应取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用湿润红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然

2、后加10%NaOH溶液1ml混匀，1%CuSO4溶液2滴，观察有无紫色出现。另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察。将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相

3、似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。B.黄色反应含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液10滴，观察颜色反应。C.茚三

4、酮反应蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。取1mL蛋白质溶液置于试管中，加10滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意：1）此反应必须在pH5～7进行；2）加热注意安全，管口禁止朝人！II.蛋白质的沉淀反应1.目的：加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。了解蛋白质变性与沉淀的关系。2.原理：在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理

5、化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。（1）可逆的沉淀的反应  此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。（2）不可逆沉淀反应  此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。蛋白

6、质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。A.蛋白质盐析作用取蛋白质溶液3ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（50%饱和浓度），微微摇动试管，使溶液混合静置5min，此时析出的为球蛋白；将上述混合液过滤，滤液中加入约一药匙硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则

7、在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。B.乙醇沉淀蛋白质取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。C.重金属盐沉淀蛋白质取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。D.生物碱试剂沉淀蛋白质植物体内具有显

8、著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团的缘故。取试管2支各加蛋白质溶液2ml及1%醋酸溶液4-5滴，向一管内滴加5%鞣酸溶液数滴，另一管内滴加饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。