实验六沉淀反应

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1、医学免疫学实验指导实验六沉淀反应由长沙达尔镩生物科技有限公司整理■【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。BioRike简介：BioRike（中文简称"博瑞克"）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌，由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室

2、，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。【实验目的】1.掌握琼脂单向扩散、双向扩散的基本原理、方法、结果分析及临床用途，2.熟悉免疫电泳的基本原理、方法。3.了解火箭免疫电泳的基本原理和方法。【实验用品】1.材料试剂：1.5%盐水琼脂、人IgG、IgA、IgM抗血清、标准参考血清；待测血清或唾液、AFP免疫血清、跻带血清、兔抗人血清、1%琼脂糖、0.5mol/LpH8.6巴比妥缓冲液。2.器材：恒温水浴锅、温箱、三角烧杯、吸管、琼脂板（塑料）、微量加样器、打孔器（

3、直径3mmX坐标纸、标尺、铅笔、电泳仪、聚苯乙烯塑料条、注射器及针头等。【内容和方法】琼脂扩散试验1.单向扩散⑴原理单向扩散系定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中首先将一定的抗血清（抗体）混合于琼脂内，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将一定量的抗原加入孔中，抗原向孔四周扩散，与相应抗体结合，在抗原抗体比例合适处形成白色沉淀环，沉淀环的直径大小与抗原的浓度呈正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线，量取待检抗原的沉淀环直径，即可从标准曲线中求得其含量

4、。该实验主要用于检测标本中的各种Ig含量和血清中补体成分的含量。（2）方法①参考血清的稀释：取冻干Ig参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01mol/LpH7.2〜7.4PBS倍比稀释成1:10〜1:160五种浓度。②免疫琼脂板制备：将适宜浓度的人Ig抗血清与预先融化好的1.5%琼脂在56°C水浴中混匀，每板内灌注3.3ml,制成琼脂板（IgG、IgA、IgM）,并做好标记。然后用3mm的打孔器在琼脂板上打孔，孔距1~1.5cm。孔内琼脂用注射器针头挑出。①加样：用微量移液器取10pl各种不同浓度的参考血清准确加入免疫

5、板的孔内，每一浓度均加两个孔，然后用上述加样方法，取10pl适宜稀释度的待测血清，加入免疫反应板的孔内。②反应：将加样的琼脂板置水平湿盘内，于37°C温箱反应24〜48小时后，取出反应板，用标尺测其沉淀环直径并记录。③标准曲线的绘制：以各浓度标准抗原的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中抗原Ig浓度含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线（见图6-1X④待测标本Ig（IgG、IgA、IgM）含量的计算：以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘其稀释倍数，即得该标本的Ig含量。⑤几种试剂的配制：A15%琼脂的配制：秤取1.5g琼脂

6、，用含0.01%柳硫汞的生理盐水100ml溶解，加热使之呈液体状。B.0.01mol/LpH7.2PBS的配制:先配制0.2mol/LNa2HPO4及NaH2PO4溶液，取72ml0.2mol/LNa2HPO4与28ml0.2mol/LNaH2PO4混合，然后用0.85%NaCI溶液稀释20倍即成。图6-1琼脂单向扩散试验的标准曲线图（3）注意事项①制备琼脂板时温度不宜过高使抗体变性失活，亦不宜太低，以免使琼脂凝固不匀。②沉淀环的直径均已mm为测量单位。2•双向扩散（1）原理双向扩散为定性试验。将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂

7、板上相对应的孔内，两者相互扩散,在比例适宜处形成沉淀线。如抗原与抗体无关则不形成沉淀线。此实验用来检测抗原或抗体的纯度，亦可用已知的抗原（抗体）来测未知的抗体（抗原X临床上常用于检测甲胎蛋白（AFP）,作为原发性肝癌等的辅助诊断。（2）方法①琼脂反应板的制备：取融化好的1%盐水琼脂3.3ml,置琼脇反内，待冷即制成琼脂反应板。②打孔:用打孔器在琼脂板上打孔，孔S巨6mm,呈梅花形排列，即中间一孔，周围六孔，将孔内琼脂用注射器针头挑出。③加样：用微量移液器取lOplAFP免疫血清准确加入中央孔内，上下孔各加10pl脐带血清作为阳性

8、对照。其余孔加等量的待测血清。④反应：将加好样的琼騎反置水平湿盘内，于37°C温箱反应24小时。⑤结果分析：待测标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线吻合，则为阳性反应。如无沉淀线出现或是与阳性对照沉淀线交叉的沉淀线则为阴性（见图6-2I图6-2双向扩散结果示意