3哺乳动物组织基因组DNA提取..ppt

《3哺乳动物组织基因组DNA提取..ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、GenomicDNAExtractionfromMammalTissue哺乳动物组织基因组DNA提取7/25/20211一、实验目的(ExperimentalPurpose)Aftertheexperimentisfinished,studentsshouldbeabletoextractgenomicDNAfrommammaltissue,andtorunanagarosegel.1.掌握动物基因组DNA提取的操作方法。2.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。7/25/20212二、实验原理(ExperimentalPrin

2、ciple)ThedetergentsSDS(sodiumdodecylsulfate)isaddedtodenatureproteinsandsolubilizelipidsinmembranesleadingtocelllysis.ThecelllysateisoftentreatedwithenzymesthathydrolyzeRNAandproteins.本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K进行水解处理。7/25/20213真核生

3、物染色体DNA组装不同层次的结构7/25/20214Thentheyaretreatedwithphenolandchloroformtoremovetheremainingproteins,whichwilleitherentertheorganicphaseor,iftheyhaddenatured,appearattheinterphase.AlcoholhelptoconcentratetheDNAwhileremovingnucleotides,aminoacids,oligonucleotidesandpept

4、ides.随后用酚︰氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。7/25/20215Wecanaddtheeathylenediaminetetraaceticacid(EDTA)tokeeptheintegrityofDNA.EDTAcanchelateMg2+andreducedeoxyribonuclease(DNase)activity,becausetheseenzymesre

5、quireMg2+towork.为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。7/25/20216本实验方法分离得到的染色体DNA长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。7/25/20217核酸的分离纯化、测定及研究方法一、分离核酸的一般原则因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结

6、构是保证核酸结构与功能研究的基础。7/25/20218（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则①保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。（二）核酸的纯度要求①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。7/25/20219（三）核酸分离纯化的注意事项为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少

7、化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行；③防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；④减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。7/25/2021

8、10高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中