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1、基因组DNA提取步骤1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中，剪碎；2.加入400ul1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润，入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）；3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min；4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后，4℃13000转/分离心10min；5.上清加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃10分钟,除
2、去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min；7.4℃13000转/分离心15min，弃上清；8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上清；9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒
3、等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产
4、生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物
5、为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/LTris·Cl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300
6、ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,60℃水浴预热。 2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。 3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套
7、,防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4.室温下5000rpm离心5分钟。 5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6.在1.5mleppendorf中加入1mlTE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8、 8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。 9.加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10.加入1/10体积的3mol/L
