真核基因组DNA提取

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1、真核基因组DNA提取2021/9/15教学内容真核生物基因组的结构及特点、人类基因组计划真核基因组提取的实验原理、操作说明、仪器使用及注意事项基因组提取后的应用：基因组文库、PCR及southernblotRNA提取方法简介核酸（DNA和RNA）定量及定性方法的介绍2021/9/15实验目的熟悉真核DNA提取的方法和原理掌握真核生物基因组的结构及特点分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等）。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染

2、应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。核酸制备的一般原则①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温④防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）。核酸制备时应注意的事项:核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于RNA，因分子较小，不

3、易被机械剪切力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。核酸制备的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。核酸制备中常用的去垢剂用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释

4、放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器

5、。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂核酸提取的一般过程2）破碎抽提核酸除去杂质1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类4．多糖的除去核酸提取的一般过程3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。核酸提取的一般过程4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0核酸提取的一般过程

6、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡注意事项——细胞裂解采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间注意事项—核酸分离

7、纯化当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解注意事项——核酸沉淀、溶解DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、