基因组dna提取教案

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1、学院检验学院系（教研室）病原生物与分子生物检验教师姓名刘二强课程名称临床微生物学与检验专业层次临床检验年级授课方式实验讲授授课时间学时授课题目：人体外周血细胞基因组DNA的提取目的要求：掌握:人体外周血细胞基因组DNA提取的原理和方法。重点难点：重点：试剂盒提取DNA的原理难点：人外周血基因组DNA酚抽提方法教具与课件：板书课外作业：1．复习人外周血细胞DNA分离与纯化酚抽提法的原理。2．完成实验报告并对结果进行分析。课后回忆（经验教训、效果估计或反应，存在问题……）：系（教研室）主任年月日-4-教学内容与组织安排：人体外周血细胞基因组DNA的分离与纯化【目的要求】：1掌握人

2、血白细胞DNA分离与纯化的原理和方法。【实验材料】：血液基因组DNA提取试剂盒：细胞裂解液CL、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱缓冲液TB、ProteinaseK、吸附柱CB3、收集管(2ml)、1.5ml离心管【实验内容】：1采用血液基因组DNA提取试剂盒利用酚抽提法提取人外周血细胞基因组DNA【实验原理】：酚抽提法提取DNA（1）分离提取DNA首先应分离出白细胞。将分散好的细胞用含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的细胞裂解缓冲液进行裂解。EDTA为二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶的活性使DNA完整的溶解在溶液中并降低细胞膜稳定性的作用。SDS作为

3、生物阴离子去垢剂，在降解细胞膜、乳化脂质和蛋白质中起重要作用。无DNA酶的RNA酶通过有效水解RNA而避免DNA的消化。（2）随后加入蛋白酶K用于水解蛋白质，消化DNA酶及DNA上的蛋白质。（3）再用Tris酚反复抽提，因为酚作为蛋白质的变性剂，使蛋白质变性溶于有机相，DNA保留在水相。Tris缓冲液能确保抽提后的DNA进入水相，从而避免其滞留于蛋白质层。重复抽提有提高DNA的纯度的作用。一般抽提三次后，便可移出含DNA的水相，用于沉淀处理。（4）沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀以去除残留的有机溶剂，并用70%的乙醇洗涤去盐，得到较纯净的基因组DNA。【实验方法】

4、：1.处理血液材料（已添加抗凝剂的1ml血液样品）：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入4μlRNaseA（100mg/ml）溶液，振荡15sec，室温放置5min。2.加入20μlProteinaseK溶液，混匀。3.加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10-4-min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。4.加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5、5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8.重复操作步骤7。9.12,000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放

6、置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10.将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min11.DNA浓度及纯度检测琼脂糖凝胶电泳核酸是两性电解质，其等电点为pH2.0～2.5左右，在常规的高于其等电点pH值的碱性缓冲溶液中带有负电荷，在电场中向正极移动。被分离的核酸分子在电场中的迁移率与凝胶浓度、被分离核酸分子的大小及构型、所加电压的

7、高低、电泳缓冲液的组成及其离子强度等因素的影响。【实验结果】：【注意事项】：1对于高分子量DNA的制备，由于受剪切力的影响很大，每一步的操作都要特别小心、温和，避免激烈的吸取、振荡与混匀。2加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般37℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。如果裂解不彻底，需要延长裂解时间或重复裂解。-4-3使用缓冲液GD、漂洗液PW前请先检查是否已加入无水乙醇。4必须将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留