细菌基因组DNA的提取

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1、实验一细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的

2、污染。2、核酸制备的一般原则一、实验原理核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。3、核酸制备的一般原则一、实验原理核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活

3、力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。4、核酸制备的一般方法和原理一、实验原理核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带

4、负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍

5、、DEPC核酸制备中常用的酶DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶核酸提取的一般过程1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂核酸提取的一般过程2）破碎抽提核酸除去杂质1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类4．多糖的除去核酸提取的一般过程3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸

6、污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、设备及试剂菌种：DBT降解菌设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：LB液体培养基、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1

7、%SDS,pH8.0）、5MNaCl、Tris-饱和酚、氯仿、RNA酶A、无水乙醇1、1.5ml菌液（每组两管）4℃12000rpm离心30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。2、每管加入400µl裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37℃水浴30min。3、每管加入132µl的5MNaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的eppendorf管中。4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后，12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则

8、说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。三、操作步骤5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积