细菌基因组DNA的提取.doc

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1、（一）细菌基因组DNA的提取1.试剂1）CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mLH2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100mL。2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K(20mg/mL或粉剂)，5mol/LNaCl。2.操作步骤：1）100mL细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。2）加9.5mLTE悬浮沉淀,并加0.5mL10%SDS,50μL20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。3）加1.5mL5mol/L

2、NaCl,混匀。4）加1.5mLCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。7）加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。8）用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1mLTE,-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。（二）细胞基因组DNA的提取Eachsample+TNESbuffer500μL+proteinase

3、K25μLà55°C,750rpm,2hrà+150μL6MNaCl,vortexàspin5min,Max,rommtemperature(RT)àisolatesupernatant+600μLcoldethanol(95%),vortexàspin5min,Max,RTàprecipitation+75%ethanol,RT,Vortexàspin5min,Max,RTàprecipitation+50μLTEbuffer(10×stocksolution),keepin4°C.（三）Chelex法抽提DNA1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温

4、下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。2.取1.5mL试管，加双蒸去离子水1mL，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出3.12000rpm离心5分钟，弃上清4.加5%chelex-100200μL、蛋白酶K5μL，置50℃水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟，灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性5.取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20℃保存备用（四）新鲜血DNA提取1.将约3mL的血块导入匀浆管中，加入8mL的裂解液进行研磨，直至血块磨匀。转入50mL的离心管中，再加入30

5、mL的裂解液，6000转离心10min，弃上清液。2.在沉淀中加入20mL的裂解液，充分震荡后6000转离心10min，弃上清。3.在沉淀中加入了1mL的抽提液和15μL的蛋白酶K，混匀后转入5mL离心管中，37°的水浴过夜或者50°水浴3小时。4.过夜的水浴液体中加入1mL的Tris饱和酚（注意的是Tris饱和酚分为液相在上层，油相在下层，加入液体必须是下层的油相物），混匀后（手摇15min），4000转离心10min，取上清液体。。5.在上清液体中加入等体积的的氯仿和异戊醇的混合液体（氯仿：异戊醇=24：1），充分混匀后（手摇15min）4000

6、转离心10min，取上清液（分入两个1.5mL的离心管中，各约600μL—800μL）6.在上清液体中加入3M的醋酸钠80μL，再加入与上清液体等体积的冰无水乙醇（-40℃保存），上下轻摇。可以见到白色絮状沉淀物，再以10000转/10min离心。7.在沉淀中加入冰无水乙醇约1mL，12000转/6.5min离心，弃上清后真空抽干。8.干燥后产物加入TE缓冲溶液10μL溶解，4℃放置五天，期间可以在摇床上晃动，然后测量浓度和OD值，然后稀释到0.1ug/μL，分装后放入-20℃保存。9.使用分光光度仪器测量DNA的OD值的时候，首先是使用酒精清洗那个

7、放入的内盒内外，然后使用TE缓冲液冲洗数遍，然后加入TE缓冲液，放入插孔，调零，然后倒掉TE缓冲液调零，加入1μL的DNA母液+49μLTE缓冲液（或2μL的DNA母液+98μLTE缓冲液），放入后测量OD值和浓度，即为母液的浓度。