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1、1分离纯化基因组DNA【目的】了解基因组DNA提取的原理与基本方法。掌握硅胶膜吸附法提取DNA的方法。2核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。核酸样品的质量直接关系到实验的成败。【原理】3DNA提取原则1：DNA片段长度（完整性）DNA提取原则2：排除其它分子污染（纯度）4破碎细胞提取纯化5破碎细胞提取纯化机械法化学法酶法6破碎细胞提取纯化沉淀法：异丙醇、无水乙醇介质吸附：硅基质:高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂磁珠7破碎细胞提取纯化沉淀法：晾干异
2、丙醇或乙醇；适量buffer溶解介质吸附：硅基质:洗杂，空甩2min,晾干；低盐高pH值洗脱89【试剂与器材】1.小白鼠（3人一组，每2组一只）2.微量加样器3.匀浆器4.动物组织基因组DNA提取试剂盒5.生理盐水10小白鼠肝脱颈处死脱颈处死右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。【操作流程】11匀浆器匀浆采用相应的蛋白变性剂和蛋白酶K进行处理，消化蛋白【操作流程】沉淀核酸消化去蛋白12【操作流程I】肝+2mL生理盐水700µL匀浆液离心12000r
3、pm,1min,弃尽上清破碎细胞加GA200µL振荡至彻底悬浮加蛋白酶K20µL56℃,60min,裂解组织，消化蛋白短暂离心（5秒）加GB200µL充分混匀，70℃,10min短暂离心（5秒）标记！！上交，-20℃保存硅胶膜吸附法消化蛋白1314【操作流程II】加乙醇200µL混匀至少15s短暂离心硅胶膜吸附法沉淀核酸裂解的样本加入吸附柱缓冲液冲洗DNA洗脱收集注意：动作要轻柔15【操作流程II】硅胶膜吸附法沉淀核酸裂解的样本加入吸附柱缓冲液冲洗DNA洗脱收集核酸吸附将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入
4、一个吸附柱CB3中；吸附柱放入收集管中；12,000rpm离心30s；倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中注意：未完全消化的组织块不要加入吸附柱中！！！16【操作流程II】硅胶膜吸附法沉淀核酸裂解的样本加入吸附柱缓冲液冲洗DNA洗脱收集核酸吸附漂洗去杂漂洗液漂洗去蛋白片段，盐分和其它杂质向吸附柱中加入500μLGD，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入700μLPW，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500μLPW，12,0
5、00rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；17【操作流程II】硅胶膜吸附法沉淀核酸裂解的样本加入吸附柱缓冲液冲洗DNA洗脱收集核酸吸附漂洗去杂洗脱DNA洗脱前要充分空甩，以除去乙醇的影响；采用合适的缓冲液注意:将吸附柱放回收集管中，12,000rpm，离心2min，倒掉废液:将吸附柱开盖放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;将吸附柱转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置5min；12,0OOrpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中洗脱
6、缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率；为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min；洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，应在7.0-8.5范围内；DNA产物应保存在－20℃。18【操作流程Ⅱ】(总结)溶液和絮状沉淀转入加PW700µL加GD500µL12,000rpm,离心30s，弃废液加PW500µL充分混匀短暂离心勿加入组织块！！检测样品浓度和纯度，余下样品，-20℃保存加乙醇200µL12,000rpm,离心30
7、s，弃废液12,000rpm,离心30s，弃废液12,000rpm,离心30s，弃废液12,000rpm,离心2min，去乙醇晾干5min加TE100µL加在膜中心！！吸附柱套入新离心管，室温放置5min12,000rpm,离心2min，收集滤液可重复洗脱动作轻柔19纯度（OD260/OD280）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数）OD260/OD280<1.7说明有蛋白的污染OD260/OD280＝1.8(1.7～1.9)说明纯度很好OD260/OD280>1.9说明有部分降解或有RNA污染
8、得率紫外分光光度计进行测量Yield＝OD260×50ng/μL×稀释倍数（双链DNA）DNA检测方法－紫外分光光度法20DNA检测方法－电泳检测取5μL洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA分子大小，纯度以及完整性电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明基因组DNA有降解。21浓度：100－300ng/uL纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程
