植物基因组DNA提取步骤.doc

《植物基因组DNA提取步骤.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、植物基因组DNA提取实验操作步骤1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。（植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。注：1、液氮的温度是-196℃，不要冻伤自己的手，带上手套。2、用一个保温杯，大一点的，把液氮取出来放在保温杯里，盖上盖子。3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。4、将样品快速放入研钵中，快速研磨，在液氮挥发完之前再加入液氮，一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态，这样样品中DNA容易降解。5

2、、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了，用药勺把样品迅速舀到1.5ml离心管里。）2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。（水浴时间依实验具体情况而定，看样品裂解情况，具体看裂解液变得清澈透明为止）3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（~13,400×g）离心5min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，

3、用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm（~13,400×g）离心30s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。）6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），1

4、2,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8重复操作步骤7。9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm

5、（~13,400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min。