实验四植物基因组DNA的提取.doc

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1、实验四植物基因组DNA的提取实验目的通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。实验原理利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。实验材料:新鲜植物叶片【仪器、材料与试剂】（－）仪器1．低温离心机2．恒温水浴器3．台式离心机4．紫外分光光度计5.液氮灌（二）材料l。三羟甲基氨基甲烷（Tris）2．乙二胺四乙酸（EDTA）3．氯化钠（NaCl）4．β-巯基乙醇5．氯化钾（KCI）6．

2、异丙醇7．乙醇8.．陶瓷研钵9．吸头、小指管（三）试剂（三）试剂1．细胞提取液100mmol／LTris.HCl(pH8.0)5mmol／LEDTA(pH8.0)500mmol／LNaCl1.25％SDS1mol／Lβ巯基乙醇2．5mol／LKCI3，TE（见实验二质粒DNA的提取及酶切）[实验步骤]1.取4g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状（越细越好）。2.转移至50ml离心管中，加入16mlTENbf，充分混匀。65℃水浴保温20min。3.从水浴中取出离心管，加入5ml5mol/LKCl溶液，混匀，水浴20min。4.4000r/mi

3、n离心20min。5.将上清液转移到另一50ml离心管中。6.加等体积酚／氯仿混匀，12000r／min离心5min，取上清。7.加等体积氯仿，混匀，12000r／min离心5min，取上清。8.加入0.6－1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。放置时间9.离心获得沉淀，70％乙醇洗3次。风干沉淀。10.加入3mlTE缓冲液，溶解DNA。11.取3mlDNA溶液测定DNA在260nm和280nm的OD值，并分析DNA的纯度和含量[实验结果]注意事项1.尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理。叶片磨得越细越好。2

4、.移液器的使用。3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。4.研钵预冻，粉末至加CTAB前不要融化。5.氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔。6.所用试剂必需灭菌。