花生浓缩蛋白的制备及其特性研究实验

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1、第一章绪论第二章花生浓缩蛋白的制备及其特性研究2.1引言2.2实验材料与试剂(1)实验材料脱脂花生蛋白粉食品级市伟(2)主要试剂木研究所用的常用生化试剂详见表2-1表2・1常用生化试剂药品名称公司名称无水乙醇(Ethanol)十二烷基磺酸钠(SDS)三瓮甲基氨基甲烷(Tris)卩■疏基乙醇邙・mercaptoethanol)N,N■亚甲基双内烯酰胺(TEMED)过硫酸钱(Ammoniumpersulfate)考马斯亮蓝R250(CoomassicbrilliantblueR250)国药集团化学试剂有限公司

2、国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂冇限公司国药集团化学试剂有限公司漠酚蓝(Bromophenolblue)冰醋酸(Glacialaceticacid)甲醇(methanol)牛血清白蛋白国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司沈阳禹王试剂公司2.2.2主要仪器和设备木研究所使用的仪器和设备详见表2-2o表2・2使用的仪器设备D-37520型高速冷冻离心机DL-6M人容量冷冻离心机Cary紫外可见分光光度计HZS-H水浴振

3、荡器SIEMENS冰箱BS223S型电子天平sartorius普及型pH计Dolphin-Doc凝胶成像系统电泳仪TS-1型脱色摇床611-DI超纯水系统Labdancer漩涡振荡器Gilson移液器电热鼓风干燥箱SORVALLBIOFUGESTRATOS公司长沙湘仪离心机仪器有限公司美国Varian公司哈尔滨市东联电了技术开发有限公司博西华家用电器有限公司北京赛多利斯仪器系统有限公司北京赛多利斯仪器系统有限公司WEALTEC公司BIO-RAD公司长沙湘仪离心机仪器有限公司德国Sartorius公司法国吉

4、尔森公司金坛市晶玻实验仪器厂2.3实验操作方法2.3.1浓缩花生蛋白制备工艺操作每次实验均使用5.000g脱脂花生蛋白粉在不同的变量(包括料液比、乙醇浓度、浸提温度、浸提时间)水平下以浸提得到花生浓缩蛋白。将完全浸润于乙醇溶液中的蛋白粉置于三介瓶屮，并放入水浴摇床屮振荡，转速设定为180r/mino到达设定时间后，将其迅速离心,离心转速为1500r/min,时间lOmin。后一次浸提以前一•次浸提的沉淀为原料。每次浸提后均采用同样的条件离心。最后一次浸提后进行鼓风干燥，干燥条件为，40°C的烘箱中鼓风干燥

5、90mim参考壬强等人［花生浓缩蛋白的制备及溶解性研究］的试验研究，设计正交试验，采用四因素，四水平条件筛选最佳反应条件。具体条件水平因素见下表：表2-3第一次浸提试验表水平料液比影响因素浸提时间(min)乙醇浓度(%)浸提温度(°C)11:1080506021:1075404531:880506041:8754045表2・4第二次浸捉试验表水平料液比影响因素浸提时间（min）乙醇浓度（%）浸提温度（°C）11:1090353021:1080252031:890353041:8802520根据止交表，进行

6、相应操作。（溶剂屮过多水分的存在使得鼓风干燥吋产物形成较多氢键，会降低了产物的溶解性。但在蛋白含量优化工艺中，过高的乙醇浓度难以将原料中的可溶性杂质溶岀，影响蛋白含量的提升。）2.3.2SDS■聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白鉴定（1）采用分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%o样品缓冲液体系为pH8.0、0.2mol/L磷酸缓冲液，样品处理方法为分别取0.02g样品蛋口和浓缩蛋口粉末溶于0.4mL缓冲液屮，旋涡混合后置于30°C水浴屮振荡4h后取出，4°C、16000rpm离心15min后，取上清25u1样品加等体

7、积2XSDS凝胶上样缓冲液，吹匀，100°C沸水中加热5min,吸取10u1混合液上样，电泳。。（2）先将电压调至75V,待染料前沿进入分离胶后（约40min）,将电压调至150V,直到浪酚蓝到达底部（总计约3h）。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶的染色将凝胶放在至少5倍体积的考马斯亮蓝R250屮，置于摇床上缓慢摇动，染色至少2ho（4）脱色处理回收染液，将凝胶浸泡在脱色液屮，在摇床上脱色过夜，至蛋口条带清晰可见，使用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行扫描、分析（具体操作参照附录3.2）。2.3.3

8、浓缩花生蛋白功能特性测定2.3.2.1溶解性测定［69］：取样品1OOmg分散丁10mL溶液中，室温下搅拌30min,分散液在1500r/min离心10min,取ImL上清液于试管中，加入4mL双缩D尿试剂，充分摇匀，在室温下放置30min,于540nm处进行比色测定。以牛血清白蛋白做标准曲线。2.3.2.2乳化性与乳化稳定性测定〔72］：称取一定量的蛋白产品溶于60mL的溶液屮，加入20mL大豆色拉油，在高速组织捣碎机中均质