eb病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

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1、EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究：陆丽君，孟锐锋，国强，朱珊丽，张丽芳【摘要】目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体，并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3×105/mL时，超声破碎，纯化获得EB病毒膜蛋白抗原；EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化，在家兔背部皮下多点免疫注射，间隔2周免疫，共3次，并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，检测兔免疫血清抗体IgG；进一步采用ethods:B95-8(EBV)cellsedium(ethod.PrepareEB

2、VmembraneproteincontainingFreundadjuvantbyroutinemethod.Fourrabbitsmunizedesinall.TheseraoftheseimmunizedrabbitsIgG.SpecificbindingoftherabbitserumantibodyandtheEBVmembraneproteinmunizedrabbitsproducedhigh-titerserumantibodyafterthesecondbooster.Thehi

3、ghesttiterofantibodyagainstEBVmembraneproteinantibodycouldbindtotheEBVmembraneproteinspecifically.Conclusion:ThespecificrabbitserumantibodyagainstEBVmembraneantigen，entofimmunologymethodfordetectionofEBVmembraneantigen.KeymunityEB病毒（Epstein-Barrvirus，

4、EBV）是一含有包膜的DNA病毒，在人群中感染非常普遍，与某些肿瘤的发生和发展密切相关[1]，如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和成人T细胞淋巴瘤等，其中鼻咽癌在东南亚及我国南方地区高发；研究发现，EBV感染尚与胃癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤的发病有一定的相关性[2-3]。EBV在感染机体时，可在宿主细胞膜上表达包膜糖蛋白及潜伏膜蛋白（latentmembraneprotein，LMP）等膜蛋白，可诱导机体产生特异性的免疫反应。因此，EBV膜蛋白是EBV病毒检测及其疫苗制备研究的靶抗原，是目前

5、EBV研究的前沿热点之一。为获得高效价的EBV膜蛋白抗体，本研究利用B95-8细胞制备EBV膜抗原，通过免疫家兔制备特异性免疫血清，并对其效价和与EBV结合的特异性进行了鉴定。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞：B95-8为EB病毒转化的绒猴白细胞[4]，购自上海中科院细胞库。1.1.2家兔：选择健康日本大耳白兔，雌性，体重1.8～2.4kg,由温州医学院实验动物中心提供，动物批号：SCXK(浙)2005-0021。1.1.3试剂：胎牛血清为Gibco公司产品，细胞培养基RPMI-1640为Hy

6、clone产品，完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂购自晶美公司，山羊抗兔IgG(H+L)-HRP购自杭州联科生物公司，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于天根试剂公司，OPD底物购于北京拜尔迪公司，预染蛋白分子量标准为ferments公司产品，其他试剂均为国产分析纯产品。1.2方法1.2.1B95-8细胞的培养：采用含10%胎牛血清及青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2条件下常规培养B95-8细胞。每天显微镜下观察细胞生长情况，并计数。1.2.2EB病毒膜蛋白抗原的制备:制备方

7、法参见文献[5-6]，即将3×105/mLB95-8细胞培养10d，经10000×g离心20min收集细胞沉淀，PBS洗涤2次，将细胞调整到2×108/mL，经超声破碎的细胞（功率10P。LMP有LMP1和LMP2两种类型，前者是目前唯一被证实能促进细胞转化甚至恶变的重要物质，其引起的免疫反应较弱；后者本身不是转化蛋白，但在EB病毒感染的患者体内可持续表达，并可诱导机体产生有效的保护性免疫应答。因此，LMP2成为EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原[9]，用于EB病毒感染相关疾病的免疫机制、疫苗设计及其

8、免疫效应等研究。根据B95-8细胞的特点，各家实验室均有报道利用其制备EBV及EBV膜蛋白进行研究。Dolken等[10]用B95-8细胞制备的蛋白，通过固相放射免疫测定法，证实用B95-8细胞可成功制备EBV膜蛋白，并且其膜蛋白复合物至少存在两个亚型。Sairenji等[11]用B95-8制备了EBV膜蛋白，发现可被EB病毒糖蛋白包膜抗原gp350/220的3种单克隆抗体所识别。本研究经P2A（54kD）和LMP2B（40kD）的分子量相一致。【参考文献】[1]SampleJ,L