结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定【临床医学毕业论文设计，】

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1、临床医学论文■结核分枝杆菌RvO3O9抗原的重组表达・纯化和鉴定作者：蒋天舒，娄加陶，周晔，陈燕，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅【摘要】日的重组表达结核分枝杆菌RvO3O9蛋白，以进一步探讨其免疫效应。方法将结核分枝杆菌抗原RvO3O9的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX4T1中，构建成RvO3O9重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达，进一步经GST亲合层析柱纯化，经SDSPAGE和Westernb1ot鉴定重组表达蛋白。结果获得了PGEX4TRvO3O9重组子，并在大肠埃希菌BL21

2、中诱导表达重组RvO3O9蛋白，其条带大小约23000，与预期结果相符。结论成功地进行了结核分枝杆菌抗原RvO3O9的基因克隆与重组表达，为进一步硏制新型结核病疫苗打下了基础。【关键词】结核分枝杆菌；RvO3O9抗原；重组表达；纯化结核病(tuberculosisTO)是全球主要传染性疾病之一，严重危害人类健康，同艾滋病、疟疾并列为世界三大疾病。全世界约有20亿人口感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)，每年新发病约800万，死亡约200万[1]°近年来，结核分枝杆菌多重

3、耐药菌株不断增加，经济全球化产生人口大规模流动，使结核病的发病率和死亡率呈上升趋势。卡介苗(BCG)是目前唯一可用的抗结核疫苗。硏究表明，BCG可预防儿童结核性脑病，但在不同的人群和地域中其保护力差异很大，并且对结核病主要流行和传播形式的成人结核病，预防效果不佳[2]。因此，硏发新型结核疫苗以替代卡介苗势在必行，选择理想的候选抗原对于硏制有效的疫苗至关重耍。国外有硏究采用基因芯片技术和生物信息学分析，从Mtb基因组中筛选出多种可能的高表达、分泌型蛋白或（和）脂蛋白，其中包括Mtb中高度保守的脂蛋白RvO3O9。

4、本硏究在此基础上，对RvO3O9进行重组表达，以进一步硏究其免疫原性，为新型结核疫苗的硏制打基础。1材料与方法1・1质粒、血清与菌株质粒pGEX4T购自AmPhamacia公司，美国。结核病血清来源于本院住院病人。大肠埃希菌BL21均为本实验室保存。1-2PCR引物设计与合成参照结核分枝村:菌H37RvO3O9的全序列，设计上下游引物。上游引物为5'GCTGGATCCGGCTTGCCGGTGAGATA3'，下游引物为5'GCACTCGAGACGGCGGCGTTGGCGACGTTT3'，在上、下游引物5'端分别引

5、入BamHI、XhoI嗨切位点和保护碱基，以便于嗨切和克隆。1・3工具酶和主要试剂限制I性内切酶BamHI、XhoI购自Takara公司；T4DNA连接酶购自Roche公司；Taq酶、IPTG购自上海博光生物科技有限公司；辣根过氧化物酶购自Dako公司。DNA凝胶I可收试剂盒购于Oxoid公司°1・4RvO3O9抗原编码区的扩增结核分枝杆菌H37Rv株接种Sauton培养基于37°C培养7周，DNA的提取和纯化参照文献［3］的方法。以人结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增反应。反应总体系为5

6、0“1，含ddH2030・0“1，lOxPCR缓冲液5・0［11，dNTPs4-0“1，模板1・0“1，特异性引物对各2・0“1(40umol/L)，Taq®1-0ul。反应条件为：PCR扩增反应条件为94°C变性1min，56°C退火1min，72°C延伸1min，35个循环后再进行72°C延伸5min。1•5PCR产物的克隆及重组转化子的鉴定回收Rv0309抗原序列的PCR产物，以BamHI、XhoI双酶切，然后与经同样酶切的PGEX4T载体连接，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，挑取转化了进行测序。1-

7、6Rv0309蛋白的表达及纯化挑取转化平皿上的菌落，接种于LB培养液中，37°C摇床培养扩增至A600为0・4左右加入终浓度为0・1g/L的异丙基硫代BD半乳糖昔(1PTG)，诱导表达4h，4°C离心收集菌液。将菌液反复冻融4次，经超声破碎仪以300W，15s，破碎4次，以上操作在冰浴中进行o而后在4°C，10000xg离心15min，收集沉淀，以含0・5%TritonX100，10mmol/LEDTA的缓冲液洗涤后，用100“1裂解缓冲液(含0・1mmol/LPMSF，8mol/L尿素，10mmol/LDTT

8、)溶解包涵体，室温放置1h。将100“1变性蛋白溶液加入到3ml的稀释变性液中，再装入透析袋中放入5L的复性液中4°C搅拌透析过夜。取出透析袋中的液体流经PBS平衡后的GST亲合层析柱，经20mlPBS洗涤后，用5mmol/L还原型谷胱甘肽溶液洗脫，收集洗脫液，进行15%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺胶电泳(SDSPAGE)分析。1・7Rv0309基因表达蛋白的鉴定将上述收获的经诱导表达PG