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《重组结核分枝杆菌mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、重组结核分枝杆菌Mr38000蛋白的表达、纯化和鉴定医学：重组结核分枝杆菌Mr38000蛋白的表达、纯化和鉴定是由(fanMycobacteriumtuberculosisZHANGMing，LIJin-cheng，LINHang(Departmentofinternalneurology,2.emergencydepartment,theFuZhougeneralhospital,FuZhou,350025,P.R.China)[Abstract]ToobtainMycobacteriumtuberculosisMr38000pro
2、teinfromH37Rv-DNA,expressefficientlyinE.coliandpurifytheMr38000proteins.Mr38000proteingeneplifiedbyPCRfromthegenomeofH37RvandclonedintopGEM-T-Easyvector.Aftersequenced,Mr38000proteingeneedigestion,namedpQE-80L-Mr38000.TheplasmidpQE-80L-Mr38000edintoE.coliDH5αandinducedb
3、yIPTG.Mr38000proteinexpressionedbyice-specificmAbagainst(His)6.Mr38000proteingeneoleculeAb.TheexpressedproteincouldbepurifiedbyNi-NTAsystemkittuberculosis(MTB)结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）是结核病(tuberculosis,TB)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。目前常用的PPD试验，常使B
4、CG疫苗接种者被误检为阳性[1]，且对后期结核患者敏感性较低，存在明显不足。近年来，有研究发现Mr38000蛋白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点[2,3]，可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌Mr38000蛋白并对其进行了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。１ 材料和方法1.1材料 MTB毒株H37Rv、DH5α由本室保存;pGEM-T-Easy及TBH37Rv全基因组Mr38000蛋白基因序列设计引物。上游引物P1:5’-AGGGGATCCGCG
5、AAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位点和起始密码子，下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’中加入EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。1.2.2Mr38000片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的MTBH37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3L液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液（10╳PCR绶冲液5μL,45g/L吐温，5μL,45g/L,NP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL）中。于55℃水
6、浴1h，沸水浴10min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μLTE中，作为DNA模板。PCR反应体系为：10╳buffer5μL,dNTPs5μL(2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL，P1，P2引物各1μL(25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR条件：94℃变性40s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环。1.2.3PCR产物的克隆与鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy进行连接反应，转化感受态DH5α，均匀涂
7、布于含有x-gal(33μL)和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG(20μL)的LB培养皿中，37℃培养16h，挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEM-T-Easy-Mr38000，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。1.2.4目的蛋白的诱导表达经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与经同样酶切的pQE-80L载体进行连接反应，转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE-80L-Mr38000。在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB培养基中过夜培养pQE-80L-Mr38000。按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3
8、h，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmoL/L，37℃继续培养4~5h。取1.5mL细菌培养物，8000g离心30s收集菌体，加入2╳样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃,5min；8000g离心5
