医学毕业论文结核分枝杆菌rpfa蛋白的表达纯化与鉴定

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1、结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定姓名：2014年6月25日作者：高辉，柏银兰，王丽梅，徐志凯，薛莹【关键词】RpfA；表达：纯化；分枝杆菌，结核Expression,purificationandidentificationofMycobacteriumtuberculosisRpfA【Abstract】AIM:ToexpressefficientlyMycobacteriumtuberculosisRpfAinE.coliandpurifythefusionproteins.METHODS:

2、RpfAgenesegmentsweredigestedwithNdelandBamHIandclonedintopcDNA3.1+vector.Aftersequencing,RpfAweresubclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpET19btogetpET19bRpfA.TheplasmidpET19bRpfAweretransformedintoE.coliDE3andinducedbyIPTGforitsexpression.TheRpfAfus

3、ionproteinexpressionwasanalyzedbySDSPAGEandconfirmedbyWesternblot.Recombinant(His)6fusionproteinswerepurifiedviaNi2+NTAaffinitychromatography.RESULTS:RpfAgenesegmentswereidenticaltothatGenBankreported(lacking5'endsof99bp).ThepET19bRpfAvectorexpressedRpf

4、AfusionproteinsatMrabout80ku，whichcouldbecaughtbyanti(His)6mAb，antiRvl884andantiRv2389immuneserum.SDSPAGEanalysisshowedthatthefusionproteinsmainlyexistedininclusionbodies.TheexpressedproteinscouldbepurifiedviaNi2+NTAaffinitychromatographyindenaturedcond

5、ition.CONCLUSION:TherecombinantexpressionplasmidpET19bRpfAhasbeenconstructedandRpfAfusionproteinsbeensuccessfullyexpressedinE.coliandpurified,whichlayabasisforfurtherstudyofRpfAfunctions.【Keywords】RpfA;expression;purification;Mycobacteriumtuberculosis【摘

6、要】目的：表达和纯化RpfA融合蛋白.方法：将含有RpfA基因片段的质粒用Ndel与BamHI双酶切，然后将目的基因片段克隆入pcDNA3.1+载体构建重组载体pcDNA3.1+RpfA,测序正确后再将目的基因片段亚克隆入pET19b原核表达载体并转化E.coliDE3,IPTG诱导表达融合蛋白，Westernblot鉴定融合蛋白.在变性条件下N12+NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋闩.结果：S的基因片段测序与Genbank报道•一致(切去了5'端99bp).SDSPAGE显示，在Mr约为80kii处有

7、表达条带，Westernblot鉴定为(His)6融合蛋白，并与小鼠抗Rvl884和抗Rv2389免疫血清有交叉反应.可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在.经Ni2+NTA亲和色谱柱纯化得到了融合有6个组氨酸残基的RpfA融合蛋白.结论：成功构建了pET19bRpfA表达载体，并在E.coliDE3屮高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白.【关键词】RpfA；表达；纯化；分枝杆菌，结核0引言复活促进因子(resuscitationpromotingfactor,Rpf)最早在.藤黄微球菌中发现，

8、它可以促进休眠期结核分枝杆菌的生长[1].Rpf样蛋白广泛存在于革兰氏阳性菌中，并参与革兰氏阳性菌生物活性[2].RpfA(Rv0867c)是结核分枝杆菌Rpf家族五种蛋白(AE)屮的一员[3].在对Rpf家族其他成员的研究屮发现Rpf样蛋白不仅与细菌的增殖有关，还奋可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原[4-5].我们表达并纯化RpfA融合蛋白，以期进一步研究RpfA融合蛋白刺激细菌增殖功能的作用机理和自身的免疫学特性，评价其作为快速培养检验结核分枝杆菌(