结核分枝杆菌rpfa蛋白的表达纯化与鉴定

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1、结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定作者：高辉，柏银兰，王丽梅，徐志凯，薛莹【关键词】RpfA；表达；纯化；分枝杆菌,结核　　Expression,purificationandidentificationofMycobacteriumtuberculosisRpfA　　【Abstract】AIM:ToexpressefficientlyMycobacteriumtuberculosisRpfAinE.coliandpurifythefusionprotEins.METHODS:RpfAgenesegmentsHIandclon

2、edintopcDNA3.1+vector.Aftersequencing,RpfAidpET19bRpfAedintoE.coliDE3andinducedbyIPTGforitsexpression.TheRpfAfusionproteinexpressionedbyr约为80ku处有表达条带，TB）的候选组分的可能性.　　1材料和方法　　1.1材料含RpfA基因片段的质粒由MikeYoung教授惠赠（Universityofillipore公司）；抗His标签mAb（北京天为时代公司）；小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血

3、清（切去His标签）为第四军医大学微生物学教研室制备.　　1.2方法　　1.2.1基因片段的测序鉴定将含有目的片段的质粒用NdeI和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段条带.再将纯化的回收产物与经同样酶切的pcDNA3.1+载体进行连接,转化感受态E.coliDE3，均匀涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养16h，随机挑取克隆进行酶切鉴定，将酶切正确的克隆送至上海博亚生物工程有限公司进行序列测定.　　1.2.2目的蛋白的诱导表达测序结果正确的质粒经NdeI和BamHI双酶切后，回收目的片段，与经同样

4、酶切的pET19b载体进行连接，转化感受态E.coliDE3，随机挑取4个克隆进行酶切鉴定.把酶切鉴定正确的阳性克隆接种在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养液中37℃振摇过夜，然后按1∶25的接种量进行转接，37℃振摇3h后加入异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmoL/L，37℃继续培养4h.取1.0mL细菌培养物，离心1min收集菌体，加入2×样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃煮10min后12000g离心10min；取上清进行SDSPAGE电泳检测，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量.　　1.2.3表达产物鉴定所

5、构建的重组质粒表达的RpfA蛋白是带有6个组氨酸标签的融合蛋白，而且表达的RpfA蛋白是与Rpf家族其它蛋白高度同源的，都含有关键的Rpf样结构域［6］.将经过诱导的细菌制成样品，进行100g/LSDSPAGE电泳，并转移至PVDF膜上，用10g/LBSA封闭过夜，分别加入抗组氨酸标签的特异性mAb，小鼠抗Rv1884免疫血清，小鼠抗Rv2389免疫血清作用1h，以10mmol/LPBS（pH7.2）洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG作用1h，以DAB显色观察表达产物.分别以未诱导细菌裂解物，第四军医大学微生物学教研室制备的ESA

6、T6MPT64融合蛋白为阴性对照.　　1.2.4表达蛋白的可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声波破碎细菌.12000g离心10min后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE分析.　　1.2.5表达产物的纯化采用Invitrogen的Ni2+NTA纯化试剂盒纯化目的蛋白.将50mL的诱导菌液离心，制备上柱样品，按照变性条件进行亲和色谱纯化，收集洗脱液进行SDSPAGE分析.　　2结果　　2.1RpfA基因片段的序列测定含有目的基因片段的质粒用NdeI和BamHI双酶切，得到大小约为1125bp的片段（图1），将

7、回收后的目的片段克隆入pcDNA3.1+载体，挑选酶切鉴定正确的克隆，经正反向全自动测序后证实目的片段序列与切去N末端99bp信号肽编码序列后的Genbank序列完全一致.　　M:DNAmarker(DL2000)；1:PlasmidRpfA.　　图1含RpfA基因片段质粒酶切鉴定（略）　　2.2表达载体的酶切鉴定将重组质粒pcDNA3.1+RpfA经NdeI和BamHI双酶切后，回收目的片段，与经同样酶切的pET19b载体进行连接，转化感受态E.coliDE3，随机挑取4个克隆进行酶切鉴定，其中2,3,4号克隆切出目的大小的片断，

8、命名为pET19bRpfA2,3,4（图2）.　　M:DNAmarker(DL2000)；1~4:pET19bRpfA质粒.　　图2pET19bRpfA质粒酶切鉴定（略）　　2.3RpfA融合蛋白的表达将重组质粒转化E.coliDE3