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《重组结核分枝杆菌mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、重组结核分枝杆菌Mr38000蛋白的表达、纯化和鉴定论文摘要从H37Rv基因组中扩增Mr38000蛋白基因并高效表达和纯化。用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Mr38000蛋白序列，将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coliDH5α，构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/Mr38000，测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coliDH5α，IPTG诱导目的蛋白表达。经r38000蛋白基因，测序结果与GeBank中报道的完全一致。SDS-PAGE显示，在Mr为38.5×103处有相应的蛋白质表达条带.freelMycobact
2、eriumtuberculosisZHANGMing，LIJin-cheng，LINHang(Departmentofinternalneurology,2.emergencydepartment,theFuZhougeneralhospital,FuZhou,350025,P.R.China)AbstractToobtainMycobacteriumtuberculosisMr38000proteinfromH37Rv-DNA,expressefficientlyinE.coliandpurifytheMr38000proteins.Mr38000proteingeneplif
3、iedbyPCRfromthegenomeofH37RvandclonedintopGEM-T-Easyvector.Aftersequenced,Mr38000proteingeneedigestion,namedpQE-80L-Mr38000.TheplasmidpQE-80L-Mr38000edintoE.coliDH5αandinducedbyIPTG.Mr38000proteinexpressionedbyice-specificmAbagainst(His)6.Mr38000proteingeneoleculeAb.Theexpressedproteincouldbe
4、purifiedbyNi-NTAsystemkittuberculosis(MTB)结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）是结核病(tuberculosis,.freel购自Promega公司；X-gal，限制性内切酶BamHⅠ,EcoRⅠ及T4-DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；IPTG,DTT,DTE,小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene公司产品。1.2方法1.2.1引物的设计与合成根据已发表的MTBH37Rv全基因组Mr38000蛋白基因序列设计引物。上游引物P1:5’-AGGG
5、GATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位点和起始密码子，下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’中加入EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。1.2.2Mr38000片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的MTBH37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3L液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液（10╳PCR绶冲液5μL,45g/L吐温，5μL,45g/L,NP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL）中。于55℃水浴1h，沸水浴10min灭活蛋
6、白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μLTE中，作为DNA模板。PCR反应体系为：10╳buffer5μL,dNTPs5μL(2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL，P1，P2引物各1μL(25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR条件：94℃变性40s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环。1.2.3PCR产物的克隆与鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy进行连接反应，转化感受态DH5α，均匀涂布于含有x-gal(33μL)和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG(20μL)
7、的LB培养皿中，37℃培养16h，挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEM-T-Easy-Mr38000，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。1.2.4目的蛋白的诱导表达经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与经同样酶切的pQE-80L载体进行连接反应，转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE-80L-Mr38000。在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB培养基中过夜培养pQE-80L-Mr38000。按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3h，加入异丙基β-D
