一步定量法TAKARA-onestep SYBR RT-PCR kit

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1、CodeNo.RR086A研究用OneStepSYBR®PrimeScript™RT-PCRKitII（PerfectRealTime）说明书v201307Da目录内容页码●制品说明1●试剂盒原理1●制品内容3●保存3●特长3●使用注意3●操作方法4●实验例8●附录8●引物设计说明9●关联产品10●制品说明本制品是采用SYBR®GreenI*1,2嵌合荧光法进行OneStepRT-PCR反应的专用试剂。使用本制品进行RealTimeRT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。本反应体系

2、由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。制品中使用了最适合于RealTimeRT-PCR的反转录酶PrimeScriptRTase和高效的PCR热启动酶TaKaRaExTaqHS，具有高扩增效率和高扩增特异性，能进行稳定的RealTimeOneStepRT-PCR反应。本制品的Buffer经过改良，使反应的特异性比使用OneStepSYBR®PrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）（CodeN

3、o.RR066A）更高。另外，反应使用的所有酶都配制成了EnzymeMix的形式，使操作更加方便简单。适用的RealTimePCR仪器*3・ABIPRISM®7000/7700,7300/7500/7500FastRealTimePCRSystem(LifeTechnologies)・LightCycler®(RocheDiagnostics)等・ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII(CodeNo.TP900/TP960)*1：SYBR®GreenI是经MolecularProbe

4、sInc.许可作为研究试剂使用，SYBR®是MolecularProbesInc.的注册商标（美国和欧洲）。*2：进行TaqMan®探针法的RealTimeOneStepRT-PCR反应时推荐使用OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)(CodeNo.RR064A)。（TaqMan®是RocheMolecularSystems的注册商标。The5'nucleaseprocessiscoveredbypatentsownedbyRocheMolecularSyste

5、msInc.andF.Hofmann-LaRocheLtd.Purchaseoftheproductdoesnotprovidealicensetousethispatentedtechnology.）*3:使用SmartCycler®System/SmartCycler®IISystem(Cepheid)(SmartCycler®是Cepheid的®注册商标)时，建议使用OneStepSYBRPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)(CodeNo.RR066A)。●试剂盒原理

6、本制品首先使用反转录酶PrimeScriptRTase将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板使用TaKaRaExTaqHS在同一反应管内连续进行RealTimePCR扩增反应（使用SYBR®GreenI嵌合荧光法监测扩增产物的生成）。1.PCRPCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。本制品中的DNA聚合酶由于使用了改良后的TaKaRaExTaqHS，从而抑制在调制反应液等低条件下由

7、引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。2.RT-PCRRNA不能作为模板直接用于PCR的扩增，但是可以通过反转录酶以RNA为模板进行PCR反应合成的cDNA对RNA进行分析，即RT-PCR技术，可对RNA进行高质量检测。本试剂盒使用OneStepRT-PCR，实验原理如下：先使用特异性引物（反向）进行反转录扩增，再以合成的cDNA为模板，以特异性引物（正向、反向）进行PCR反应。（不能使用随机引物和OligodT引物进行反转录反应。）-1-OneStepRT-PCR的原

8、理3.荧光检测法[嵌合荧光法]在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR®GreenI，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增目的DNA片段的融解温度。Primer1．热变性Polymerase2．引物退火3．延伸反应-2-●制品内容（50μl反应×100次）1.2×OneStepSYBR®RT-PCRBuffer4*1