EAE大鼠第四脑室外侧隐窝凋亡细胞探究

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1、EAE大鼠第四脑室外侧隐窝凋亡细胞探究【摘要】目的观察凋亡细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠第四脑室外侧隐窝的变化，探讨该部位结构与免疫调节的关系｡；方法建立急性EAE大鼠模型，应用脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡｡；结果EAE时外侧隐窝凋亡细胞具有明显的时程特异性｡；结论该部位免疫反应强烈，为一敏感区｡；❷【关键词】实验性自身免疫性脑脊髓炎；第四脑室外侧隐窝；凋亡细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎是一种T细胞介导的中枢神经系统(CNS)自身免疫性疾

2、病｡；近年来研究发现，细胞凋亡与EAE发病有关,尤其在EAE愈复和免疫耐受形成中起重要作用[1-2]｡；EAE时脑凋亡细胞的研究报道较少，而应用TUNEL技术对脑室周器官及第四脑室外侧隐窝进行凋亡细胞研究未见报道｡；该研究应用TUNEL技术,在EAE大鼠模型的不同时程，观察外侧隐窝凋亡细胞的数量､；分布，并结合组织结构的变化，探讨该部位结构与免疫调节的关系｡；1材料与方法❷1.1材料❷本研究用雌性Wistar大鼠（体重200g±20g）24只，豚鼠（400g±20g性别不限）5只&

3、#65377；动物由河北省动物实验中心提供｡；光镜观察组和TUNEL实验观察组各12只，分别分为正常对照､；EAE潜伏期（7d）､；发病极期（14d）､；恢复期（21d）各3只进行实验｡；TUNEL试剂盒购自北京中山公司｡；❷1.2方法❷1.2.1EAE模型的制备及评分标准按照曹翠丽［3］等建立EAE模型的方法，制成急性EAE大鼠模型｡；对照组大鼠不做任何处理｡；❷1.2.2取材及样品制备分别将对照和实验组大鼠于免疫后7､；14

4、5380；21d分批进行麻醉&W65380；灌注､；取脑块（第四脑室外侧隐窝处）后固定､；常规石蜡包埋､；切片厚5um､；漂浮法贴片&W65377；进行常规HE染色制备切片｡；TUNEL样品制备:梯度酒精置换､；蛋白酶K消化､；0.3%H202甲醇液室温孵育､；冰上孵育后，加上TUNEL反应液50ul,在湿盒中371下孵育lh,加入50ul转化剂-POD,在湿盒中37°C下孵育30min,加入底物DAB溶液，室温下孵育10min｡；标

5、记过程中,每步间用PBS冲洗｡脱水&W65380；透明､；苏木素复染､；封片｡；室温风干后，显微镜观片,OLYMPUS万能显微镜照相｡；❷1.2.3统计学处理所有数据输入SAS6.12统计软件，采用配伍组设计方差分析，任意两组之间的比较采用q检验｡；❷2结果❷2.1光镜观察结果❷正常对照组大鼠第四脑室外侧隐窝室管膜细胞呈单层，细胞排列稀疏｡；潜伏期室管膜细胞呈单层排列密集，室管膜下组织疏松，血管丰富､；扩张｡；发病极期室管膜细胞排列

6、更加密集､；呈多层排列，室管膜下见极度水肿，室管膜层与其下层有部分分离，血管周围及室管膜下有大量的炎性细胞浸润（图1）｡；恢复期组较发病极期组水肿明显消退｡；❷1.2TUNEL方法检测结果❷对照组外侧隐窝室管膜及室管膜下未见TUNEL阳性细胞;潜伏期出现TUNEL阳性细胞;并随病情进展增多，至疾病高峰期，室管膜及室管膜下､；血管周围区TUNEL阳性细胞达最高水平（图2）；恢复期TUNEL阳性细胞数量较高峰期递减;在恢复期同一蜡块相邻部位切片作TUNEL阴性对照，未发现TUNEL阳性细胞（图3&

7、#65380；4）｡；❷2.3在外侧隐窝室管膜区域随机观察五个视野，统计阳性细胞数见表1｡；经统计学处理:EAE实验组与正常对照组比较差异均有显著性（P