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1、不同强度力竭运动大鼠运动后12h肝细胞凋亡探究摘要：研究对象、方法:利用细胞免疫组化的方法研究力竭运动后12h成年雄性SD大鼠肝细胞凋亡同肝细胞内的自由基水平和钙代谢之间的关系。结果：1)运动组与C组相比，凋亡细胞的数量差异显著(p投稿日期：2009-10-15作者简介：陈伟，讲师，硕士研究生，研究方向运动人体科学。1研究对象与方法1.1研究对象及运动方式研究对象为成年雄性SD大鼠30只，体重(215.2±16.8)g,月龄为8周龄，并随机将其分为对照组(C)、中等强度力竭运动组(ME)、大强度力竭运动组(HE),每组10只；运动方式根据Berdford动物运动模型[
2、1],采用电动跑台。运动组先进行适应性跑台练习然后按不同强度力竭运动进行实验，中等强度力竭运动组初始速度为10m/min,持续时间12min,逐渐增加运动负荷，达到速度为19.3m/min(相当于76%V•；02max)、持续到力竭。坡度为10°。大强度力竭运动组初始速度为26.8m/min(相当于92.3%V•；02max）,持续到力竭。坡度为10°。1.2实验仪器与试剂主要仪器：820轮转组织切片机、NikonE600显微照相图像采集系统、722型光栅分光光度计、PT动物跑台等。主要试剂：原位末端标记细胞凋亡检测试剂盒、SOD.MDA,GSH,
3、蛋白定量，Ca❷❷2+❷试剂盒（皆购于南京建成生物工程有限公司）等。1.3标本制备❷1.3.1血清制备大鼠断头颈部取血3mL,室温静置、离心10min,取上清液即血清。1.3.2组织取样对照组与运动组大鼠分别于安静状态和运动后12h断头处死，取肝左侧叶，投入3.7%的福尔马林缓冲固定液中固定4〜8h后进行常规石蜡包埋。取样本0.2g,剪碎后加入9%的冰生理盐水，用电动匀浆机在冰水浴中进行匀浆,匀浆液离心后提取上清液。1.4检测指标TUNEL标记切片用NikonE600显微照相图像采集系统进行照相以检测细胞凋亡数量、HE染色观察肝细胞的整体结构、采用黄嚓吟氧化酶法测定S
4、OD活性、采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量、采用二硫代二硝基苯甲酸法，测定GSH（谷胱甘肽还原型）的含量、采用甲基百里香酚蓝比色法检测肝组织线粒体Cag2+❷浓度。1.5统计学分析所有的数据用平均值土标准差（X土S）表示。组内差异比较，采用单侧t检验;组间差异采用方差分析法，显著性水平为a=0.05。所有数据分析采用SPSS12.0软件。2结果2.1力竭运动后12h大鼠肝细胞的凋亡状况及肝组织的形态改变1.1.1TUNEL阳性标记肝细胞凋亡状况细胞凋亡时,DNA双键断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3'-0H末端，就可在TdT（terminal
5、deoxynucleotidyltransferase）的作用下，将脱氧核糖核昔酸和HRP（PeroxidaseHorseradish辣根过氧化物酶）形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，该物质与DAB（diaminobenzidine二胺基联苯胺）发生显色反应，使凋亡的细胞核呈现出棕色，而正常的细胞核会被甲基绿复染为绿色（图1）。表1力竭运动后12h大鼠肝细胞的凋亡状况组别数量细胞凋亡指数对照组101.80±1.65中等强度力竭运动组1035.60±8,41❷❷*#够大强度力竭运动组1014.65±3.75^**代表运动组与安静组比,*P表5力竭运动后12h大鼠肝细
6、胞线粒体内的Ca❷❷2+❷的含量组别数量Ca2+含量/nmol•；HigproO^T❷对照组100.23±0.12中等强度力竭运动组100.91土0.36❷❷**#❷大强度力竭运动组102.05±1.25❷*3讨论本研究发现运动组相对于C组均出现明显的细胞凋亡,且ME组的细胞凋亡更明显。原因可能同运动性缺血再灌注引起的肝组织中氧自由基水平和钙离子浓度相关。3.1运动性缺血/再灌注引起的氧化应激同大鼠肝细胞凋亡的关系近年来，运动诱发肝细胞凋亡机制的研究已成为运动医学研究的热点。国内外不少实验证明［2-5］：运动性肝氧化应激是诱发大鼠肝细胞凋亡的重要因素之一。缺
7、血/再灌注中引起肝组织内氧化应激的氧自由基(oxygenfreeradicals,0FR)主要通过线粒体、黄11票吟氧化酶、激活的中性粒细胞呼吸爆发及儿茶酚胺的自身氧化途径产生。目前认为黄p票吟氧化酶途径［6］和中性粒细胞的呼吸爆发途径［7,8］是缺血/再灌注时OFR产生的主要途径。1.1.1氧化应激中中性粒细胞的呼吸爆发缺血期通过线粒体途径、黄嚓吟氧化酶、儿茶酚胺的自身氧化等途径(特别是黄嚓吟氧化酶途径)产生一定量的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),ROS是各种炎症诱发因子如TNF-a［9］、脂多糖(lipopolysa
