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1、氯化钆诱导大鼠腹腔巨噬细胞内质网应激及凋亡探究【摘要】目的探讨氯化钆对大鼠腹腔巨噬细胞内质网应激和凋亡的作用。方法分离和培养大鼠腹腔巨噬细胞(PMΦ),分别经氯化钆(Gd)和衣霉素(Tunicamycin)处理后,采用细胞免疫组化S-P法检测ARMET的表达,免疫荧光双标染色检测ARMET和CHOP的表达,PI染色观察对细胞凋亡的影响。结果氯化钆处理组细胞数目减少,胞体变小变圆;ARMET在氯化钆组(5×10-6mol/L)的阳性细胞百分数为(42.1±6.6)%,在正常对照组的阳性率为(6.1±1.6)%,差异有统计学意义(P0.05);免疫荧光双标
2、染色提示氯化钆组ARMET和CHOP均高表达;PI染色可见氯化钆组细胞被深染、胞核断裂等凋亡特征。结论氯化钆可诱导大鼠腹腔巨噬细胞内质网应激和凋亡,其作用机制可能与胞内钙超载引起的非折叠蛋白反应有关。【关键词】氯化钆;巨噬细胞;内质网应激;凋亡StudyofendoplasmicreticulumstressandapoptosisofperitonealmacrophageinratinducedbyGadoliniumchlorideHUANGXue-gui,ZHAOJun.HefeiWomenand8ChildrenHealthCenter,He
3、fei230000,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofendoplasmicreticulumstressandapoptosisofperitonealmacrophageinratinducedbyGadoliniumchloride.MethodsRatperitonealmacrophage(PMΦ)wereisolatedandcultured.AfterPMΦtreatedwithGadoliniumchlorideandTunicamycin,theexpressionofAR
4、METwasdeterminedbyimmunohistochemicalmethod,immunoflurorescentdoublestainingwereemployedtodetecttheexpressionofCHOPandARMET,PIstainwasusedtoobservePMΦsapoptosis.ResultsTheamountofcellsweregreatlyreducedandthecellbodywereshrinkedtoroundinGdCl3group.ThepercentageofcellARMETpositiv
5、e-expressedwere(42.1±6.6)%inGdCl3group(5×10-6mol/L),whilethevalueofcontrolgroupwere(6.1±1.6)%,thedifferencebetweenthetwogroupswassignificant(P1.1.2PMΦ给药方案将PMΦ培养至第78d,细胞融合达到80%时进行给药处理。试验分为正常对照组、GdCl3组、Tunicamycin组。①正常对照组:分为两组,每组细胞分别加入与②、③组等量的生理盐水与DMSO溶媒。②GdCl3组:精密称取GdCl3.6H2O晶体7.
6、9mg溶于生理盐水,充分溶解后过滤除菌,得5×10-3M的母液,取母液4μl加入4mlDMEM中,混匀后换液,每孔加1ml,培养24h后处理。③Tunicamycin组:取用DMSO配制的2.5mg/ml的母液用DMEM按1:1000稀释,每孔加1ml,培养4h后处理。以上各组均设四个复孔。1.2.3细胞免疫化学PBS摇洗10min×2次,用预冷的4%多聚甲醛4℃固定30min,再用含0.1%BSA+0.1%皂角素的PBS,4℃封闭30min。每孔滴加一抗(ARMET,1:20,用含0.1%BSA+0.1%皂角素的PBS稀释)100μl,4℃孵育过夜。
7、次日PBS洗后滴加带HRP标记的猪抗兔二抗(1:100)37℃孵育1h,DAB显色,苏木素复染,盐酸酒精分色,蓝化,滴加DAPI染核,PBS洗10min×2次后,荧光显微镜下观察,摄像。1.2.4免疫化学阳性细胞计数在DAB显色的细胞组织化学玻片上,用高倍镜(×400)每孔随机取五个视野计数阳性细胞,每组按四孔计数,求出阳性细胞的百分数,并以(x±s)表示。1.2.5细胞免疫荧光双标染色PBS摇洗10min×2次,用预冷的4%多聚甲醛4℃固定30min,再用含0.1%8BSA+0.1%皂角素的PBS,4℃封闭30min。滴加两种一抗,4℃孵育过夜。次日
8、用PBS洗后滴加1:500稀释的两种荧光标记二抗,37℃避光孵育1h。用PBS洗10min×2
