FasL的制备及其诱导EAE淋巴细胞凋亡的实验研究

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1、中文摘要FasL的制备及其诱导EAE淋巴细胞凋亡的实验研究fFasL诱导表达Fas的细胞发生凋亡是目前研究的热点，研究t表明它与自身免疫病、淋巴增生性疾病、肝炎、多发性硬化、移植排斥等疾病的发生发展有关。FasL一般表达在激活的T细胞、NK细胞、某些肿瘤细胞，及眼、睾丸、胎盘等免疫豁免区组织细胞膜上，通过与F勰分子的配接，使表达Fas的细胞发生凋亡。人类FasL分子是典型的II型膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族，由281个氨基酸构成，分子量为31．759kD，编码基因是由分隔开的四个外显子组成，定位于一号染色体q23区。FasL分子可在一定条件下被金属蛋白酶切割下来，与胞

2、膜解离，形成可溶性的形式。在某些疾病中，血清中有高水平的sFasL，一些自身免疫病中有高效价的sFasL抗体，阻断了Fas-FasL介导的自身反应性淋巴细胞的凋亡。多发性硬化(MS)是一种中枢神经系统脱髓鞘病变，常导致青壮年严重残疾，缓解与复发交替出现。尽管进行了大量的研究，但病因和机制至今未明。最近的研究表明MS病人体内存在着针对髓鞘碱性蛋白(MBP)的自身反应性T细胞，由此介导了自身免疫病的发生。研究表明，MS的缓解与复发与这种MBP特异的自身反应性T细胞的出现和删除紧密相关。但MBP．T细胞的死、亡和导致的组织损伤机理研究至今未取得突破性进展。r、一一为了阐明Fa

3、s．FasL在MS中介导自身反应性T细胞的删除机理，我们进行了下列三部分实验。主要内容和结果如下：第一部分．膜FasL的纯化及其凋亡诱导功能的鉴定：，我们应用亲和层析柱，从表达FasL的HepG2细胞膜蛋白抽提液中分离纯化FasL分子。实验证明用本法纯化的FasL分子量为31～33kD，SDS—PAGE呈现单一条带，Western．Blot表明所提取的膜蛋白为人FasL。细胞学检测该蛋白能诱导表达Fas的细胞发生凋亡，并且在一定浓度范围内呈现量．效关系。第二部分．FasL胞外区(sFasL)基因的原核表达及其产物的，免疫活性测定：／我们将FasL胞外区编码基因克隆入表达

4、载体pQE．31，转化大肠杆菌DH5Q，经大量培养，IPTG诱导表达，沉淀被裂解后，再经Ni．NAT亲和层析，制各了纯度较高的sFasL蛋白，SDS—PAGE电泳显示了在20kD处有一单一条带，经Western—Blotting鉴定，能与抗FasL抗体结合。随后我们再用PIERCE公司的内毒素去除胶去除内毒素，进行凋亡诱导功能的检测，显示了活性，但相对较弱。第三部允FasL诱导EAE淋巴细胞凋亡的实验研究．／为了阐明Fas．FasL是否参与了MS中自身反应性T细胞的删除，我们用人髓鞘碱性蛋白(MBP)力n福氏完全剂，诱导KM小鼠，建立了MS的动物模型．实验性变态反应性脑

5、脊髓炎(EAE)，分析了EAE淋巴细胞膜上Fas及FasL分子的表达，并检测了分泌的细胞因子，分别用所制各的人FasL及糖皮质激素甲泼尼龙诱导EAE淋巴细胞凋亡。信果表明：Fas．FasL在EAE淋巴细胞的删除中发挥了重要作用。d上结果，为进一步研究FasL分子的结构功能、制各抗体提供了材料，为进一步的临床应用包括寻找MS的治疗策略打下了基础。广了一关键词：FasL，亲和层析、纯秘，(罾目岂凋亡，淋巴细胞，多发性硬化，实验性自身免疫性脑脊髓膜炎AbstractindetaiIsPurificationofFasLandinvestigationofFas—FasLmed

6、iatedapoptosisoflymphocytesinexperimentalautoimmuneencephalomyelitis．ThereisconsiderableinterestintheFasLthatcaninduceapoptosisofFas—bearingcells．RecentstudieshavedemonstratedthatFas／FasLsystemisimplicatedinthepathogensisofseveralhumandiseaserangingfromA1DS．autoimmunediseasestotransplant

7、rejection．FasLisexpressedonthesurfaceofactivatedTcells．variouscarcinomhcells．Sometissuecellsinimmuneprivilegesitesuchastests，eyesandplacentacanconstitutivelyexpressingFasL．TheinteractionofFasLontheeffectorcellswithFasonthetargetcellscaninduceatransductionofdeathsignalinth