EAE时第四脑室外侧隐窝的形态学研究

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1、中文摘要EAE时第四脑室外侧隐窝的形态学研究摘要目的：对EAE不同时期的大鼠第四脑室外侧隐窝形态学进行动态观察，探讨该部位室管膜及室管膜下结构的变化特点以及与功能的关系。材料与方法：选择健康Wistar雌性大鼠64只，体重2009±209，主动免疫，制备EAE模型。在免疫后，7天为潜伏期组，14天为临床极期组和21天为恢复期组，健康Wistar雌性大鼠作为对照组。常规经心灌注固定取脑的第四脑室外侧隐窝，分别对该部位室管膜及室管膜下进行光镜结构观察(HE)；细胞凋亡的形态学观察；扫描电镜以及透射电镜观察。1EAE模型制备：动物腹腔内注射6％水合氯醛(0．5ml／1009体重)麻醉后，碘酒、酒精局

2、部消毒，用豚鼠脊髓匀浆加完全福氏佐剂(GPSCH．CFA)制成的乳剂，每只脚垫皮内注射GPSCH．CFA乳剂0．1ml，共计0．4ml。2光镜标本制备：动物腹腔内注射6％水合氯醛(0．5ml／1009体重)麻醉，打开胸腔，经心升主动脉快速灌注37℃生理盐水，同时剪开右心耳，生理盐水灌注量100ml。从右心耳流出的液体变淡后，迅速换成4％多聚甲醛磷酸缓冲液(O．1M，pH7．2)进行快速灌注，动物出现抽搐僵直的现象为最佳效果，快速灌注200ml后再慢速灌注此液200ml，整个过程需40分钟。灌注完毕取出整脑，去除脑桥以上部分和延髓以下的部分，取中间脑组织块在上述固定剂中(4℃)后固定24中文摘要

3、小时，然后在磷酸缓冲液(O．1M，pH7．2)中冲洗三次，每次6小时，再用梯度酒精脱水，入二甲苯中透明，浸蜡，包埋，修块，石蜡连续切片，载片捞片，60℃烤箱过夜。然后依次入二甲苯脱蜡，梯度酒精置换，苏木精染色及伊红复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。室温风干后，显微镜观片，OLYMPUS万能显微镜照相。3TUNEL样品制备：动物的麻醉、灌注、取材和后固定、石蜡切片过程同光镜标本制备，切片厚5／xm，标记过程如下：梯度酒精置换入水后，蛋白酶K消化(2吮g／m1)30分钟，0．3％H202甲醇液室温孵育30分钟，冰上孵育2分钟后，加上TUNEL反应液50ul，在湿盒中37℃下9呼育1小时

4、，加入50ul转化剂一POD，在湿盒中37℃下孵育30分钟，加入底物DAB溶液，室温下孵育10分钟。标记过程中，每步间用PBS冲洗。脱水、透明，苏木素复染，封片。室温风干后，显微镜观片，OLYMPUS万能显微镜照相。4扫描电镜样品制备：麻醉、灌注方法同光镜标本制备，但灌注液为4％的多聚甲醛和2．5％戊二醛磷酸缓冲液(O．1M，pH7．2)(多聚甲醛磷酸缓冲液灌注前一天配出，4。C保存；戊二醛在灌注之前再加入多聚甲醛溶液)。灌注完毕取整脑，然后经正中线切开整脑，将脑分为左右两块在上述固定剂中(4℃)后固定12小时。取一侧脑块从背侧移去小脑，暴露第四脑室底和外侧隐窝，沿着中脑上端，延髓下端冠状方向

5、将多余的脑组织去除，之后将脑组织块放入磷酸缓冲液(O．1M，pH7．2)中过夜后，再用上述磷酸缓冲液冲洗切块三遍，然后梯度酒精脱水，叔丁醇置换，二氧化碳临界点干燥，真空喷金，日立S．3500N观察、照像。中文摘要5透射电镜样品制备：取材过程同扫描电镜样品制备，在灌注固定后，经正中线切开整脑，从背侧去除小脑，暴露出第四脑室底，切取外侧隐窝入口处脑块3x3x2mm，然后投入1％锇酸固定液作后固定，磷酸缓冲液冲洗三次，梯度酒精脱水，Epon812包埋，LI①一V型超薄切片机切片，H一600型透射电镜观察照相。结果：1光镜观察结果：正常对照组室管膜细胞排列稀疏；EAE大鼠潜伏期(7天)组室管膜细胞排列

6、密集，室管膜下组织疏松，血管丰富、扩张；发病极期(14天)组室管膜细胞排列更加密集，室管膜下组织极度水肿，室管膜层与其下层有部分分离，血管周围及室管膜下有大量的炎性细胞浸润；恢复期(21天)组室管膜细胞排列密集，室管膜下组织疏松，血管扩张。2TUNEL组化细胞凋亡的观察结果：光镜下凋亡细胞的形态呈棕黄色或棕褐色着色，典型的凋亡细胞形态学改变为细胞变小变圆，核固缩。正常对照组偶见凋亡细胞，实验组EAE潜伏期室管膜细胞出现凋亡细胞、发病极期室管膜及室管膜下血管周围凋亡细胞密集，恢复期凋亡细胞数量递减。凋亡细胞排列的密集程度，经统计学处理，EAE实验组与正常对照组比较差异均有显著性(P

7、14天组与7天组和21天组比较有显著性差异；7天组与21天组无差异。3扫描电镜观察结果：本研究在电镜下观察到EAE大鼠第四脑室外侧隐窝室管膜细胞有分泌现象，分泌颗粒呈囊泡球形，表面光滑，多成堆集中分布，出口处发现有大量的巨噬样细胞和淋巴样细胞。中文摘要结论：1第四脑室J,t-{贝0隐窝室管膜及室管膜下，凋亡细胞在EAE组较正常对照组明显增多，发病极期凋亡细胞达最多，凋亡细胞随EAE时程呈单峰变化趋