EAE时室周器官正中隆起的形态学研究

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1、中文摘要EAE时室周器官正中隆起的形态学研究摘要目的：对EAE不同时期的大鼠正中隆起(ME)进行动态形态学观察，探讨该室周器官在机体不同免疫状态下的变化。方法：选择健康Wistar雌性大鼠72只，体重180．2009,主动诱导制备EAE模型，在免疫后6小时，7天，14天和21天(分别为柔膜反应期组、潜伏期组、发病极期组、恢复期组)，对ME进行HE染色、TUNEL技术检测凋亡细胞、扫描电镜、透射电镜观察。lEAE模型制备：用豚鼠脊髓匀浆加完全福氏佐剂，主动免疫Wistar雌性大鼠，在免疫后6小时(柔膜反应期)，7天(潜伏期)，14天(发病极期)，

2、21天(恢复期)四个时间点，常规经心灌注固定，取脑，分别以HE和TUNEL技术检测凋亡细胞，扫描电镜，透射电镜，观察ME形态学变化。2光镜标本制备：常规经心灌注，固定，取脑，冠状方向去除视交叉以前和漏斗柄以后部分，留取中间部分脑块后固定24小时，然后在磷酸缓冲液(0．1M，pH7．2)中冲洗三次，每次6小时，再用梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，修块，用Leica石蜡切片机连续切片，片厚5、m。常规HE染色，脱水，透明，封片。显微镜观察，OLYMPUS万能显微镜照相。3扫描电镜样品制备：麻醉、灌注方法同光镜标本制备，中文摘要但灌注液为1．5

3、％的多聚甲醛和2．5％戊二醛磷酸缓冲液(0．1M，pH7．2)灌注完毕取材：将脑腹面朝上，在视交叉两侧各lrnm平行做两道矢状切口向后延伸至漏斗柄，在漏斗柄后做一冠状切口，在距离脑底面3mm处做一平行切口，所取下的脑块即含ME，观察时腹面朝下，上面的小凹即为脑室面，视交叉为前，漏斗柄为后。将取1-ME用PB冲洗后置于2．5％戊二醛(4℃)中。双蒸水冲洗，梯度酒精脱水，叔丁醇置换，二氧化碳临界点干燥。真空喷金。日立S一3500N扫描电镜观察，照相。4透射电镜样品制备：取材过程同扫描电镜样品制备，在灌注固定后，取ME组织块放入4％戊二醛中固定，l％

4、锇酸固定1h，Epon812包埋，LKB—V型超薄切片机切片，T一7500N型透射电镜观察照相。5TUNEL实验组样晶制各：动物的麻醉、灌注、取材和后固定、石蜡切片同光镜标本制各，常规脱蜡、入水，蛋白酶K消化，0．3％H202甲醇液封闭，冰}：透化后加上TUNEL反应液，POD转化，DAB显色。HE复染，常规脱水、透明、封片。OnMPUS万能显微镜观察并照相。6凋亡细胞评价标准及统计学处理：强微镜下观察，以胞核固缩，深棕黄色的细胞为阳性染色。随机选取5个不重叠视野，采用自动免疫组化分析系统Version2．0记录阳性细胞数。采用单因素方差分析，

5、有显著差异者用q检验进行两两比较，以p<0．05为有显著差异。结果：1光镜观察结果：HE染色，对照组ME室管膜细胞呈单层柱状排列，EAE潜伏期、发病极期，室管膜细胞排列密集，呈双层或复层排列，以发病极期最明显。柔膜反中文摘要应期和恢复期接近于对照组。室管膜细胞排列的密集程度，测量每50x50#m2细胞数，发病极期>潜伏期>柔膜反应期和恢复期。2扫描电镜观察结果：对照组ME处少纤毛区可见丰富的分泌颗粒，大小均匀，表面光滑，直径0．2—3．0#m。实验组ME表面的分泌颗粒形态、分布形式、大小出现明显变化，在柔膜反应期大的分泌颗粒(赢径约1．0一1．

6、5舯)减少，小的分泌颗粒(直径约O．3舯)增多，排列更加稠密；潜伏期时分泌颗粒以大的为主，排列稀疏；发病极期时ME表面分泌颗粒减少，相互粘连似葡萄状，室管膜上可见大量吞噬细胞样细胞附着，于这些细胞上还可见到正在形成的分泌颗粒；恢复期室管膜表面分泌颗粒基本正常，有的部位相互粘连成团状或条索状，仍可见到散在吞噬细胞样细胞。3透射电镜观察结果：EAE大鼠免疫后6小时，柔膜反应期时，可见室管膜细胞内大量细胞器聚集于细胞的游离缘，线粒体密集，室管膜下层细胞出现胞质肿胀，充满水肿空泡，直径约400．600nm，在血管周围可见丰富的线粒体聚集现象。潜伏期时，

7、室管膜细胞不同的分泌现象在该处皆可见到。有的分泌颗粒呈球形，赢径约5．0#m，与室管膜细胞脱离；有的分泌颗粒呈蘑菇状，部分与室管膜细胞相连，无胞膜，内含许多有膜囊泡，结构松散。于发病极期可见室管膜细胞向外凸起，形成较大的分泌颗粒，长椭圆形，有胞膜，最大径约2．5#m，未见空泡，均质状，较致密，细胞内有溶酶体吞噬现象；于室管膜上可见较多的直径为250．400nm的分泌颗粒。在恢复期室管膜细胞表面也可见到分泌颗粒，但形态不规则，最大径3．5#m，内含多种囊泡，约50个，大中文摘要小不等，圆形、椭圆形；紧贴于室管膜细胞下层，可见电子密度高的细胞，胞质

8、浓缩，细胞核皱缩，折曲，可能是小胶质细胞。4TUNEL实验组观察结果：对照组仅见个别凋亡细胞。计数50×50／zm2范围内凋亡细胞数(爿土s)。潜伏期