生化制备技术实验操作指导

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1、生化制备技术实验操作指导温州大学生命与环境科学学院2012年2月实验须知1.实验室规则(1)实验课须遵守实验室开放时间，应B觉遵守课堂纪律，严禁在实验室吃东西、人声喧哗等行为。每组成员可按个人时间协作完成实验过程，但必须每位成员都参与到实验当中,并由组长预先捉交实验分工安排书，交予指导教师作为签到依据。(2)使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂污染。(3)实验台、试剂药品架必须保持整洁，仪器药品摆放井然有序。实验完毕，需将药品、试剂排列整齐，仪器洗净倒置放好，实验台面抹拭干净，经教师验收仪器后，方可离

2、开实验室。实验仪器为配套使川，不可随意调换。每组组长在实验进行Z前及结束Z后负责对仪器和耗材进行清点，及时反映问题。(4)使用和洗涤仪器时，应小心谨慎，防止损坏仪器。使用梢密仪器吋，应严格遵守操作规程，发现故障应立即报告教师，不要自己动手检修。(5)在实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录木1：0课后写出实验报告，实验课程完全结束后rti学习委员收齐交给教师。(6)仪器损坏吋，应如实向教师报告，认真填写损坏仪器登记表。(刀实验出现问题，不建议盲目重做，应及时总结原因，给出合理解释。实验

3、课不完全以最终实验结果为评分依据，更重要的是考察分析问题和解决问题的能力。(8)每次实验课安排同学轮流值LL值LI生要负责当天实验的卫生和安全检查。1.实验记录实验课询应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一贝。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验屮观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录木上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。2.实验报告的书写实验结束后，应及吋整理和总结实验结果，写出实验报告。(1)标题

4、标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验纽号、实验者及同组者姓名、实验室条件。(2)实验目的(3)实验原理应简述革本原理，不要完全照抄实验指导

5、几（4）操作步骤操作步骤（或方法）可以采用流程图的方式或自行设计的表格來表达。（5）实验结果将实验屮的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽址使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。（6）讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。3.生物化学实验课评分标准♦实验预习情况（20%）♦实验操作情况（20%）♦实验报告悄况（20%）亲

6、和层析法纯化胰蛋白酶实验一鸡卵粘蛋白的提取【实验目的】掌握鸡卵粘蛋白的基本性质以及提取、分离和纯化的:基本原理和方法；学习鸡卵粘蛋白对胰蛋ft酶抑制活性测定的基木技术【实验原理】鸡卵粘蛋口是由四个分子量相近的亚基组成的糖蛋口，相对分子量在28000Da左右，糖基部分主要含有D-廿露糖，D-半乳糖，衙萄糖胺，唾液酸，等电点在3.945之间。鸡卵粘蛋白在鸡蛋清中含量丰富，并R与鸡卵清蛋白性质相比，具冇较好的化学稳定性。在80C条件卜:理化性质不发生改变；在50%的丙酮溶液中，能保持良好的溶解度；在10%的三氯乙酸的溶液中不发生沉淀；在PH3.0的溶液中

7、稳定，但在pH8.0的溶液中容易分解。表1.鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液屮的溶解度溶液pH鸡卵粘蛋白鸡卵清蛋白=3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%<3.5沉淀f溶解/沉淀t溶解1>3.5沉淀丨溶解t沉淀1溶解f通过选择合适的pH值、三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从鸡蛋清中获得鸡卵粘蛋白的粗体液。如表1.所示，鸡卵粘蛋白和清蛋白在不同pH值的10%TCA溶液小具有不同的溶解状态。由于鸡卵粘蛋白具有良好的稳定性，在pH3.5的10%三氯乙酸溶液屮鸡卵粘蛋白能保持良好的溶解度，而与英共存的清蛋白绝大部分被沉淀出来，这样就可以初步将二者分开。溶解在1

8、0%的三氯乙酸中的鸡卵粘蛋白通过内酮沉淀而获得粗品，再经阴离子交换柱色谱进i步分离纯化就可获得较纯的鸡卵粘蛋白。【器材与试剂】1.器材pH酸度计（pH试纸）、磁力搅拌器、圆环、玻璃漏斗、低速离心机、50ml离心管、滤纸、真空干燥器、循环水式真空泵、储液罐、色谱柱（30X3cm、20X3cm）、抽滤瓶、胶塞、恒流蠕动泵、紫外检测仪、记录仪、自动部分收集器、铁架台、双拧丝、万能夹、透析袋、透析袋夹2.试剂(1)10%TCA溶液，pH1.15(50ml/组)(2)0.05mol/L,pH8.0Tris・HCI缓冲液,(内含0.2%CaCI2)200ml(

9、3)2mmol/LBAEE底物溶液200ml(4)lmg/mLTrypsin标准溶液10ml(5)0.2mol,pH6.6