动物生化实验技术指导书

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1、动物生化实验技术指导书动物生化实验技术指导书实验一底物浓度对酶活性的影响——碱性磷酸酶米氏常数的测定一、实验原理1.在温度、pH利酶浓度一定时，底物浓度对酶活性（V）的影响，可用米氏方程表示为：V二Vmax[S]Km[S]lVmax时，Km2式中Vmax为最大反应速度，Km表示米氏常数，[S]表示底物浓度，当V二=[S]。Km是酶的特征性常数，测定酶的Km值是研究酶性质的重要方法之一。人多数酶的Km值在0.01—lOOmMZ间。対于不同的底物，酶有不同的Km值。本实验以碱性磷酸酶为例，测定在不同底物浓度时酶活性的变化。然后再分别以1[S]为

2、横座标，以1为纵座标作图，从图上可以方便地求出碱性磷酸酶的Km值。V2.在本实验中，利用分光光度比色法测定酶的活性。碱性磷酸酶可作用于多种底物。当它作用于磷酸苯二钠时，释放出酚。酚在碱性溶液小与4—氨基安替比林作用，并经铁氧化钾氧化工成红色的醍类化合物，该化合物在510nm处有显著光吸收。与标准酚的溶液作对照或制作标准曲线，可计算出在不同底物浓度时酶的活性。显色反应的原理如下：二、试剂：1.酚贮存标准液：溶解（AR）酚lg于0.lmol/L盐酸中，用0.lmol/L盐酸稀释至1L。此酚溶液含量约为lmg/mLo须进行标定。标定方法见上海市页

3、学化验所主编《临床生化检验》上册第十章，酚类测定。2.酚应用标准液（O.lmg/mL）:使用前将酚贮存标准液用蒸馆水稀释10倍。此液只能保存2〜3天。3.0.lmol/L碳酸缓冲液（pH=10）:溶解3.18g无水碳酸钠和1.68g碳酸氢钠于500mL蒸係水中。1.0.5mol/LNaOII500mLo溶解10gNaOH于500mL蒸傳水中。1.O.Olmol/LTris-醋酸缓冲液(pH=8.8):配制0.1mol/LTris溶液lOOmL,另配制0.1mol/L的醋酸镁溶液lOOmLo将二种溶液混合,加蒸憎水至900mLo用1%醋酸调节

4、pH至8.8,再用蒸馆水加至1L。2.0.5%铁氤化钾溶液：分别溶解5g铁鼠化钾和15g硼酸于二份400皿蒸僻水中，将二种溶液混合，加蒸馆水至1L,棕色瓶保存。3.0.3%4—氨基安替比林溶液：溶解3g4一氨基安替比林和42g硫酸氢钠于lOOOmL蒸镭水屮。置棕色瓶屮冰箱保存。8・0.04mol/L底物溶液:溶解10.16g的磷酸苯二钠(含二个结晶水)于lOOOmL煮沸冷却的蒸傳水屮，加氯仿数滴，贮于棕色瓶屮，冰箱保存，可用一周。9・5mg/100mL碱性磷酸酶溶液：溶解5mg碱性磷酸酶(Sigma,No.3877)于100mI.pH=&8

5、Tris-酷酸缓冲液中，冰箱保存。三、操作1.酶反应进程曲线的制作。该曲线冇助丁•找到合适的酶反应时间以测定初速度，以及估计出介适的酶量与底物浓度，为米氏常数测定作准备。A.取五支试管，编号，依次加入0.4mL底物溶液，0.9皿碳酸缓冲液，0.6M蒸锚水。另取同样数量的试管，编号，作为空白对照管，用蒸饰水代替底物溶液。B.充分混匀，置37°C水浴中，保温5分钟。C.在各管中加入碱性磷酸酶溶液0.ImL,立即混匀，在37°C水浴中，分别准确反应5,10,15,20,25分钟。D.反应用1.OmL0.5mol/L的NaOH终止，接着依次加入1.

6、OmL4—氨基安替比林，2・0mL铁氟化钾溶液,充分混匀，10分钟后，测定0D510或A510。E.分别以0D510为纵座标和反应时间为横座标，画出酶反应进程曲线。2•米氏常数的测圧取8支试管，编号，按下表操作，注惠准确吸取酶和底物的量。终止反应的方法，同操作(1)屮所述，以0号管为空门对照，测定各管的OD510,记录结果。四、结果:1.计算岀各管的底物浓度[S],用01M表示。2・利用公式：0D标准管C标准管=0D未知管C未知管C为浓度，计算出各管的酶活性U,用酶活力单位数表示。木实验中，定义在37°C下，10分钟产生lmg酚为一个酶活力

7、单位。1.将米氏方程式转化为Lineweaver-Burk方程式,得1lKml1=+。以[S]Vmax[S]VmaxVKmll为纵朋标作图。为直线斜率。纵坐标的截距为，直线与横VmaxVmaxV1座标相交于，以求得Km值。Km为横座标，以实验二蛋白质浓度测定一一双缩脈法目的要求学习双缩腺法测泄蛋白质的原理和方法。原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脉反应，因此蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋门质浓度呈正比，故可用來测定蛋门质的浓度。+试剂和器材一、测试样品1.标准蛋白溶液lOmg/mL牛血淸白蛋白溶液或相同

8、浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氮氧化钠溶液配制）o作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏立氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液。2.测试样品液犊牛（鸭）血清（稀