生化实验技术指导书

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1、生化实验技术指导帖《牛物技术人实验》实验指导书生物技术教学部常平安舒坤贤谢永芳编重庆邮电V院牛物信息学院2005年3月1日—1—刖P《牛物技术人实验》是为牛物技术专业本科高年级学牛开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子牛物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进，R新月界。分子牛物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对牛命科学的进步产牛了举世公认的巨人推动作川，而且对人

2、们的牛活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到牛物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学启关的研究领域。21

3、比纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学牛基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导巧是开好实验课的基木条件Z-o虽然冃前的分了生物

4、学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国者2005年3月实验一质粒的提取和纯化3实验二质粒DNA的电泳和纯度检测6实验三PCR产物的TA克隆实验山感受态大肠杆菌细胞的制备12实验五重组DNA转化大肠杆菌12实验六PCR扩增基因特异片段15实验七DNA片段的回收及纯化19实验八PCR法快速鉴定重组载体22实验九限制性DNA探针制备38实验十四Southern印迹杂交41实验

5、•五Northern印迹杂44实验十六荧光原位杂交（FISH）技术47实验十七外源

6、基因在哺乳细胞中的表达及其检测实验十八生物芯片技术技术实验二十蛋白质组技术本技术路线25053实验十九RNAi5658附录基因工程基60实验一质粒的提取和纯化实验H的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用为最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的冇利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利川酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相屮进行分离的酸酚法;利用疑基磷灰石在特定的条件下（跖01/L尿素,0.24mol/L磷酸缓冲液

7、pH=6.8）只吸附双链DNA的轻基磷灰石法（在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链）等。木实验选做的是碱法。1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酚、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。対于不同的菌耍选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法（简称碱法）等。三种方法比较而言，非离了型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。2.分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原

8、理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到人于12时双链DNA屮的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调冋中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分了，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的冃的。3.纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除

9、。RNA可用牛胰RnascA分解除去。蛋白质可通过酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿冇强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很冇好处。氯仿还能将微最的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对•于以后的陆切、转化等过程都会产牛•不利影响。氯仿/界戊醇的蛋白质变性能力鮫弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。正确的去除蛋片质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（（1:1））一氯仿（或氯仿/异戊醇24:1）,处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿/异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后

10、的水溶液屮仍有痕虽的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，R同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。实验10g细菌培养用酵母粉5gNaCl1Og用lO