生化实验技术指导书.doc

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1、生化实验技术指导书　　生化实验技术指导书《生物技术大实验》实验指导书生物技术教学部常平安舒坤贤谢永芳编重庆邮电学院生物信息学院xx年3月1日前言《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。　　该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。　　分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。　　分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社

2、会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。　　分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。　　21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。　　学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。　　而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。　　虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物

3、技术大实验教材尚无出版。　　实验原理质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。　　最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。　　本实验选做的是碱法。　　1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。　　对于不同的菌要选用不同

4、的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。　　三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。　　常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。　　2．分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。　　碱法的分离原理如下大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。　　当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链

5、解离成单链的变化。　　再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。　　3．纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。　　纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。　　RNA可用牛胰RnaseA分解除去。　　蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。　　氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过

6、程都会产生不利影响。　　氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。　　正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。　　抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。　　用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。　　实验10g细菌培养用酵母粉5g3NaCl10g用10mol／LNaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌,4℃贮存.2．溶液Ⅰ，

7、可成批配臵，灭菌后4℃贮存。　　葡萄糖Tris-C1(pH8.0)EDTA3．溶液Ⅱ(新鲜配制)NaOH0.2mol／LSDS1％4．溶液Ⅲ5mol／LKAc冰醋酸水60ml11.5ml28.5ml50mmol／L25mmol／L10mmol／L配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L醋酸(pH4.8)卡那霉素(Kana):50mg/ml,过滤除菌.5．重蒸酚市售苯酚蒸馏纯化(收集179～181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。　　6．氯仿异戊醇(24:1)7．无水乙