生化实验技术专题.doc

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1、生化实验技术专题主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事项;介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。目录第一节生物大分子物质的制备第二节几种主要的生物化学实验技术第三节生物分子的检测第一节生物大分子物质的制备%1.一般过程•材料的选择和处理•确立测定方法•细胞的破碎•有效成分的抽提•有效成分的浓缩%1.注意事项%1.纯化方案的设计和评价例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化b分离纯化方案设计的基本原则是:在分离纯化过程中即要得到高纯度的产品，又要使大分子物质活

2、性损失最小。b基本路线包括四个阶段：1、前处理细胞破碎2、粗分级硫酸鞍分段盐析法、乙醇沉淀法、等电点沉淀法等。3、细分级凝胶过滤法，亲和层析4、质量鉴定测定蛋白质的含量和纯度生物大分子分离纯化的一般步骤1层析法］电泳法生物组织T无细胞提取液T粗产品一］超离心法’T结晶.超滤>

3、-前处理T

4、一粗分级-

5、-细分级-

6、•材料选择与处理■盐析（硫酸统盐析）•细胞破碎（机械破•等点电沉淀碎、溶账和自溶、•有机溶剂沉淀酶解、化学处理）（•透析几种主要沉淀方法比较方法原理优点缺点应用范围1.沉淀法操作简便、成本低廉.对蛋白质或醉有保护作用.重复性较好分辨力差

7、,纯化倍数低，蛋白质沉淀中混杂大量盐分蛋白质或酶的分级沉淀和结2•有机溶刑沉淀法脱水作用和降低介电常数操作筒便,分辨力较强对受白质或醉有变性作用.成本较高多和物级蛋肽多质沉3•选择性沉淀法等电点、热变性.酸緘变性和特殊的可逆沉淀作用选择性较强，方法简便，种类较多黠范围各种生垓大分子兹质的沉淀调整硫酸鞍溶液饱和度计算表（硫酸镂最终浓度％饱和度）10202530333540455055606570758090100每升溶液需加入固体硫酸饺的克数05611414417619620924327731335139043047251656166276710

8、57861181371501832162512883263654064494945926942029597891123155189225262300340382424520619253049619312515819323026730734839048558330193062941271621982352733143564495463312437410714217721425229233342652235316394129164200238278319411506403163971321682052452853754694532659913417

9、121025033943150336610113717621430239255336710314117926435366534691051432273143470107190275703572153237753611519880771579079注意事项1.控制适当的pH2.控制低温3.注意提取过程中的溶液环境4.防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基硫酸鞍分级沉淀蛋白质的原理b基本原理：硫酸钱沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质

10、竞争水分子，从而破坏蛋白质表而的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出來。b各种蛋白质的溶解度不同，I大「『U可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。b血浆为例：加到盐浓度20〜30%时纤维蛋白原沉淀，再加到浓度50%时球蛋白沉淀。b硫酸钱因英溶解度大，温度系数小、不易使蛋白质（酚）变性、利于分离而应用最广。宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸钙沉淀2129801412.64694、盐析41771464

11、8.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、结晶0.12130107219.703（U/mg蛋白）(%)(nig)(U)第二节几种重要的生物化学实验技术一、层析技术二、电泳技术三、离心技术一・层析技术（chromatography）1.层析技术一般原理2.层析技术分类及应用层析技术原理层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使

12、各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：样品原点到斑点