生化实验指导

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1、实验一缓冲溶液的配制和氨基酸两性性质测定一、目的要求1．了解缓冲溶液的作用原理及缓冲原理，学习缓冲溶液的设计、配制及酸度计的使用方法。2．观察甘氨酸的两性性质和缓冲作用。二、实验原理能抵抗一定量酸或碱的影响，而保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。缓冲液一般是由弱酸或弱碱与它的盐组成。如乙酸和乙酸钠组成乙酸缓冲液、硼酸和硼砂组成硼酸缓冲液等。缓冲液可分为一般缓冲液(或通用缓冲液)和标准缓冲液两类。标准缓冲液pH值是一定的(与温度有关)，叫做pH标准液，当用酸度计测量溶液的pH值时，就要用pH标准液来校正仪器。一般缓

2、冲液的pH值可用下式计算：式中的Ca、Cb、Cs分别为弱酸、弱碱、盐的浓度(mol/L)；Ka、Kb分别为弱酸、弱碱的电离常数；Kw为水的离子积。当温度一定时，pKa(或pKb)为一常数，因此缓冲液pH值就随着盐和酸(或碱)的浓度比值而变化。如果制备缓冲液时所用的盐和酸的浓度相同，则配制时所取盐和酸的溶液的体积比就等于它们的浓度比，故上式可写为：可见只要按盐和酸溶液的毫升数的不同比值配制就可得到不同pH值的缓冲液。如加水稀释，其盐和酸的浓度都以相同比例降低，比值不变，因此适量稀释不影响缓冲液的pH值。缓冲液能抵抗一定

3、量酸或碱的作用称缓冲作用，缓冲作用的大小称为缓冲能力或缓冲容量(β)，可定义为每升缓冲液改变一单位pH值所需加入强碱或强酸的量(摩尔数)。一种特殊的酸和它相配对的碱在它们浓度相等(即pH值等于酸的pKa)时，缓冲能力最大。缓冲能力除与其共轭酸碱对的比率有关外，还与总浓度有关，总浓度越大，缓冲能力越强，一般缓冲液浓度在0.05～0.20mol/L，pH=pKa±1的范围内具有满意的缓冲能力。α－氨基酸是一类两性物质；既可以和酸作用，又可以和碱作用，对酸、碱的加入具有一定的缓冲能力；通过甘氨酸的酸、碱滴定及测量不同浓度的

4、酸、碱条件下甘氨酸溶液的pH值，绘出—条滴定曲线，从中可以看到这种变化。三、仪器及器材酸度计，碱式滴定管，移液管，三角瓶，容量瓶，烧杯四、试剂1．0.1mol/L，0.01mol/LNaOH2．0.1mol／L，0.01mol/LHCl3．0.1%溴麝香草酚蓝溶液4．Na2HPO4·2H2O(化学纯)5．KH2HPO4(化学纯)6．0.1mol/L甘氨酸溶液五、操作方法1．磷酸缓冲液的配制及pH值的测定：（1）母液的配制：A液（0.1mol/LKH2PO4）：称量1.36gKH2PO4定溶100mL。B液（0.1mo

5、l/LNa2HPO4）：称量3.58gNa2HPO4定溶100mL。（2）不同pH值的磷酸缓冲液的配制：取三个50mL的三角瓶，编号，按表1-1操作：表1-1磷酸缓冲液pH值的测定试剂（mL）三角瓶号1230.1mol/LKH2PO4241560.1mol/LNa2HPO461524pH计测定结果计算结果混匀后用酸度计测定三种缓冲液的pH值，并填入表1。2．稀释对缓冲液pH值的影响：取2个三角瓶，编号，按表1-2操作；表1-2稀释对缓冲液pH值的影响试剂（mL）三角瓶号450.1mol/LKH2PO4157.50.1

6、mol/LNa2HPO4157.5蒸馏水015指示剂显色（3滴）淡蓝淡蓝pH计测定结果混匀后分别在各管中加入3滴麝香草酚蓝指示剂，比较试管溶液的颜色，并用酸度汁测定4、5号三角瓶中的pH值，填入表2。3．不同浓度的缓冲液缓冲能力的测定：取2个三角瓶，编号，按表1-3操作；表1-3不同浓度的缓冲液缓冲能力的测定试剂（mL）三角瓶号670.1mol/LKH2PO40.660.1mol/LNa2HPO42.424蒸馏水270总浓度0.01mol/L0.1mol/L指示剂显色（3滴）浅蓝浅蓝pH计测定结果用HCl滴定(刚变色

7、)消耗的量(用0.01mol/LHCl滴定)(用0.1mol/LHCl滴定)pH计测定结果计算结果测定滴定前和滴定后6、7号三角瓶中的pH值，并填入表3。4．测定甘氨酸的滴定曲线取50mL三角瓶15个，编号，按表1-4数据加入试剂，充分摇匀后分别测定pH值。表1-4甘氨酸的滴定曲线的测定1234567891011121314150.1mol/L甘氨酸溶液（mL）5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.00.1mol／LHCl（mL）0.00.51.02.02.53.04

8、.05.0－－－－－－－0.1mol/LNaOH（mL）－－－－－－－－0.51.02.02.53.04.05.0蒸馏水（mL）15.014.514.013.012.512.011.010.014.514.013.012.512.011.010.0pH六、数据处理及结果分析1.缓冲液pH值的计算：按下列公式计算三角瓶1、2、3中溶液的pH值(K