生化实验指导-编辑

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1、实验氨基酸的分离鉴定纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基木原理及操作方法。二、原理纸层析法:是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂:由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：Rf=原点到层析中心的距离/原点到容剂前沿的距离材缸剂剂器析试展、层、扩三k曙1>在-•定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因索冇关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。2、毛细管3、喷雾器4、培养血5、层析滤纸（新华一号）650mL是由4份水饱和的止丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL止丁醇和5mL冰

2、醋酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡,静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养JHL中备用。2、氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、纟颉氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（齐组份浓度均为0.5%）o各5mL3、显色剂50〜100mL0・1%水合前三酮正丁醇溶液。1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2、取层析滤纸（长22cm^宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2〜3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。3、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过

3、3mm。4、扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液而需低于点样线1cm）o待溶剂上升15-20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，口然干燥或用吹风机热风吹干。5、显色用喷雾器均匀喷上0。1%前三酮正丁醇溶液，然后置烘箱屮烘烤5分钟（100°C）或用热风吹干即可显出各层析斑点。6、计算各种氨基酸的Rf值。思考题1、何谓纸层析法？2、何谓及f值?影响只f值的主要因素是什么？3、怎样制备扩展剂？4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？OMHzCFh0nh2赖氨酸(Lys或K)脯氨酸(Pro

4、或P)缎氨酸(Vai或V)O苯丙氨酸(Phe或F)亮氨酸(Leu或L)CH3・3H2OCH3次甲基蓝酒石酸钾钠实验三还原糖的测定一、原理原糖的测定采用快速法。其反应与粗淀粉测定相似，不同点为斐林试剂甲液中硫酸铜量较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氧化钾(黄血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更为明显。Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH二、试剂2.1斐林试剂甲液：称取35g硫酸铜，0.05g次甲基蓝，用水溶解并定容至1000mlo乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化钠，9.4g亚铁氧化钾，用水溶解并定容至

5、lOOOmlo2.20.1%标准葡萄糖溶液精密称取l.OOOOg经95〜105°C烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，加入5ml盐酸，用蒸饴水定容至1000ml,摇匀。三、仪器与设备(1)三角瓶(2)容量瓶(3)分析天平(4)干燥器(5)电热恒温干燥箱(6)滴定管(7)称量瓶(8)移液管(9)屯炉四、测定步骤4.1斐林试剂的标定吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管屮预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄擄溶液1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4〜5秒钟1滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色

6、消失，此滴定操作需在1分钟内完成，总耗糖量为VOmb4.2定糖预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入VI毫升试样稀释液(含葡萄糖量约为5〜15毫克)及适量的0.1%标准葡萄糖溶液,摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V2毫升。正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶屮，加VI毫升试样稀释液和(V2-1)毫升0.1%标准葡萄糖溶液，补加[(V0+10)・(Vl+V2)]毫升水，摇匀，以卜•同标定时操作，总耗糖量为V毫升。重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值Vmlo5计算还原糖=(V0-V)*C*n*l/Vl式中V0：斐林试剂标定值(

7、毫升)V：斐林试剂测定值(毫升)C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升)m试样稀释倍数vl：所取试样稀释液体积(毫升)6说明(1)滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等，对测定精密度影响很大。平行测定的滴定毫升数相差不应超过0.1ml,故在标定、预备、正式测定过程屮,实验条件应力求一致。(2)滴定过程应该始终保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的毫升数应控制在0.5〜lml内，否则应重新测定。(3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低