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1、蔗糖酶的制备.检测及其性质研究一、酵母蔗糖酶的制备［目的要求］掌握从生物材料中提収酶蛋门的方法学习低温操作技术和冷冻离心机的使用［实验原理］蔗糖酶（invertase）（P—D一咲喃果糖昔果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的a-咲喃果糖莒键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解牛成葡•萄糖和果糖，也能催化棉籽糖水解，生成密二糖和果糖。啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细跑壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白质得到粗酶制品，述可用柱层析
2、进一步纯化得到精制品。［试剂和器材］1.试剂（1）啤酒酵母、二氧化硅（细砂）、去离子水（冷至4°C左右）、冰块、一20°C预冷无水乙醇。2•器材研钵、冰浴、离心管3支、滴管3支、50mL量筒1个、100mL烧杯2个、pH试纸、高速冷冻离心机、台秤。［实验步骤］1•准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。样殆的制备：2.秤取lO.Og干酵母置研钵中，加10mL预冷的去离子水，拌匀。力112.0gSiO2,边搅拌边逐滴加入预冷的去离子水20mL,每次滴加约2mL,至少用30分钟，充分研磨至糊状（研磨约需60min）,至酵母细胞大部分破碎，蔗糖酶充分转入水
3、相。3.将糊状物转移至50mL离心管中，丁•高速冷冻离心机4°C10000rpm离心10mino如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管小心地取出脂肪层下而的水相，转入另一个清洁的离心管中，4°C,10000rpm,离心lOmino将清液转入量筒，量出体积，留出l.OmL测定酶活力及蛋白含量。此为“粗级分I”。4.剩余清夜转入50mL清洁离心管中，用广泛pH试纸检查清液pH,以lmol.L1乙酸调pH至5.0,迅速放入50°C恒温水浴中，保温30分钟，保温过程中不断搅动离心管。取出离心管，于冰浴中迅速冷却,4°C,lOOOOrpm,离心l
4、Omim将上清液转入量筒,量出体积,留出l.OmL测定酶活力及蛋白质含量（此为“热级分II”）。5.乙醇沉淀将热处理后的上淸液，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积的・20°C预冷的95%乙醇，并轻轻搅拌（约需30min,注意速度缓慢，否则产热升温），冰浴继续放置10min,以沉淀完全。4°C,lOOOOrpm离心10min,弃去上清液，沉淀保存于离心管屮，盖上盖子或薄膜封口，放入冰箱屮冷冻保存（此为“醇级分III”）。［实验结果］记录三级分样品特征及体积［注意事项］1.所有全部器皿必须清洗T•净，去离子水清洗2〜3遍，防止金属
5、离子对酶的彩响。2.全部过程低温操作3.预冷水要逐渐加入，充分研磨。4.加等体积无水乙醇，一定要慢，边滴加边搅拌。二、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定［实验目的］掌握酶活力蛋口质浓度的测定方法；熟悉酶纯化倍数和冋收率的计算方法。［实验原理］评价酶的纯化步骤和方法，需测定各级分酶活性和蛋白含量，计算比活力、纯化倍数及冋收率。测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson，s试剂法、水杨酸试剂法等，木实验采用水杨酸试剂法。蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等鼠的徊萄糖和果糖，每水解lmol蔗糖，生成2mol还原糖。采用3.5-二硝基水杨酸法测定还原
6、糖的含量，可计算蔗糖梅水解蔗糖的速度。其原理是3.5—二硝基水杨酸为还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的含量与棕红色物质的颜色深浅成正比，利川分光光度计进行比色测定，计算水解液屮的还原糖含量。本法操作简便、快速，杂质干扰较少。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。比活力：酶的总活力单位数除以总蛋口吨数，即每mg蛋口所含有的酶活力单位数。回收率：每一步所测得的总活力数与第一步总活力数之比值，以白分比表示。假设第一步回收率为100%。纯化倍数：每一步所得的比活力与第一步比活力Z比，开始时提纯倍数假设为1。［试剂与器材］1.试剂
7、（1）3,5•二硝慕水杨酸试剂：甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL10%NaOH溶液中，并用水稀释至69mL,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称収255克酒石酸钾钠加到300mL10%NaOH溶液中，再加入800mL1%3,5-二硝基水杨酸溶液。甲、乙二溶液相混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7・10天以后使用。（2）lmg/mL葡萄糖溶液：准确称取100mg®萄糖溶于溶于去离子水，并定容至lOOmL,即得浓度为lmg/mL的标准葡萄糖溶液。（为防止时间长溶液长菌，可以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100mL）（3）10
8、%蔗糖溶液：（4）250ug/mL牛血清溶液（JIJTris-HCl缓冲液配制）（5）0.2mol.L"乙酸缓冲液，pH4.5o（6）牛
