生化制备技术

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1、1.激活蛋白AP-1是由组Fos和Jun蛋白组成的，它通过调节基因的表达来应对多种刺激。试设计从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验方案并说明理由。从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验方案从Hela细胞小分离纯化AP-1的实验步骤如F：Hela细胞J低渗膨胀细胞Dounce氏匀浆低速离心细胞核Jo.42mol/Lkcl提取高速疡心硫酸後沉淀核提取物JS300凝胶过滤S300峰组分J序列特异性DNA亲和层析部分纯化的AP-1图示：从Hela细胞中部分纯化AP-1的实验流程图实验一：Hela细胞核提取物的制备。在本实验中，

2、基木上是按照Dignam等所述的方法从Hela细胞中制备核捉取物的。首先，将Hela细胞置于低渗缓冲液中孵育，细胞体积因渗透膨胀作用而增大。然后，将膨胀的细胞置Dounce氏匀浆器中匀浆使Z裂解，离心收集细胞核。然后，将细胞核置于含0.42mol/LKCI的缓冲液中孵育，提収转录因子AP-1O然后，lOOOOOg离心1小时，将溶解状态的转录因子AP-1与细胞核的包膜及基质分开，所得上清液即是细胞核提取物。最后，用硫酸钱沉淀上清液中的转录因子AP-1,再重悬于层析缓冲液中，离心去除不溶物后，即可加载于SephacrylS-

3、3OO凝胶柱进行层析。注：1.将Hela细胞置于液氮中冷冻保存，温度为-80°Co2.在细胞核的制备过程中，除了特别的说明以外，所有溶液均应保存于4°C,所有操作应在4°C下进行。实验二：SephacrylS-300HR凝胶过滤层析首先，取SmIHela细胞核提取物样品进行凝胶过滤层析，留取50此提取物供随后的测活分析用。然后，对XK26/40柱，采用卜列柱参数：直径二2.6cm,柱长=34cm,体积二180ml,流速二100ml/h,缓冲液二TM缓冲液+0.lmol/1KCLo然后,于S-300柱加5mlHela细胞核

4、提取物样品,分部收集5ml组分。然后,从S-300柱洗脱所得的各组分留取50M等分试样，供DNA廨I足迹分析实验用。然后，各组分在24小时内使用，可储存于4°C；若长期保存，则需液氮保存于・80°C以下。然后，用DNA酶I足迹法测定各组分中的AP-1的DNA结合活性。最后，含AP-1活性峰的S-300柱组分可直接上序列特界性DNA亲和层析柱。注：1.所冇操作均在4C环境下进行。2.凝胶过滤层析的关键一步是样品进入填料床。3.蛋白质溶液的冻融是蛋白质化学研究能否获得成功的重要环节之一。实验三：序列特异性DNA亲和层析首先，

5、纯化序列特界性DNA结合蛋白AP-E然后，非特界性DNA结合蛋白的误纯化。在Heb细胞提収物中，用DNA亲和层析纯化的蛋白质组分中常见的杂蛋白质有两种：一种是聚腺昔二磷酸核糖聚合酶，分子量为116000Da；另一种是Ku抗原，由分了量为70000Da和80000Da两种多肽组成。然后，亲和层析前DNA结合蛋口AP-1的部分纯化。有儿项注意事项对DNA结合蛋口AP-1的纯化很有用的：离子交换层析，肝素-琼脂糖是-•种很通用的介质，非特异ftDNA-纤维素和DNA琼脂糖凝胶,不含待分离转录因了结合位点的序列特异性DNA亲和介

6、质,麦胚凝集素亲和层析，凝胶过滤层析。最后，亲和层析用寡核甘酸序列的确定。以下儿点很重要：寡核昔酸的长度，5'突出端，寡核昔酸序列与DNA酶I足迹的关系，介成寡核昔酸的纯度，亲和介质的蛋白接合容虽，纯化AP-1和Spl用的寡核昔酸（1•用制备的凝胶电泳纯化寡核昔酸：使用的是聚内烯酰胺凝胶,样品以及DNA的回收。2.DNA亲和介质的制备:寡核昔酸的5'-磷酸化,寡核昔酸的连接,偶联Sepharose用DNA制备，川渙化氤将DNA偶联丁•Sepharose,川CNBr活化的Sepharose将DNA偶联于Sepharoseo

7、3.亲和层析中非特界性竞争DNA的正确使用：竞争DNA的选择以及用虽估算，竞争DNA的制备。4.亲和层析的操作：全部操作在4C下进行。讨论：DNA酶I足迹分析与凝胶迁移率变动分析优缺点比较：DNA酶I足迹分析技术如下：序列特异性结合因了与一单端标记的双链DNA探针一起孵育，使该因了与DNA片段上它的识别位点相结合。然麻，能使每条双链DNA产生一个单链切口的条件下，用DNA酶I轻度消化结合因子-D¥A复合物。而保护因子所结合的DNA区域，使其免于被DNABI所消化。结果所得的消化后的DNA酶I混合物，用凝胶装證进行电泳。放

8、射自显影后，比较有序列特异性DNA结合因了与无特异性的结合因了产生DNA酶I消化梯。与不含结合因了的对照相比，在DNA酶I消化梯上DNA片段与因子结合的区域显示一条空白带，即为“足迹”。凝胶迁移率变动分析技术如下：DNA结合因子先与标记的双链DNA探针一•起孵育，然后该因子DNA-蛋白质复合物在非变性的条件下直接电泳