人IL-17基因克隆、表达及其单克隆抗体制备

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1、学位论文原创性声明木论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做岀贡献的个人和集体，均己在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名:办什门艸日期:砰乙年主月二日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电了和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文

2、的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。本论文属于：保密（），在年解密后适用本授权声明。不保密（J）0（请在以丄括号内打U・j〃）作者签名：丿丨丨內导师签名:创/明头/j：_月—JL-g明对°年立月止近年来在CD4T淋巴细胞的Thl、Th2细胞亚型外，发现了一个新的细胞亚型Thl7o其在炎症反应自身免疫性疾病及肿瘤等疾病中均发生作用。白介素17(interlukin-17,lL17)是Thl7细胞的主要效应分子，IL-17家族其他分子是近年来广泛关注的一类细胞因子。IL17-A最早是在1993年发现，被命名为杀伤性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-8

3、)，但研究发现其与CTLA家族其他成员间结构功能无相似之处随后的研究发现CTLA-8作为一个分泌型分子，其功能类似于细胞因子，因此被命名为IL-17o人IL-17A是由155个氨基酸组成的相对分子质量(Mr)为32000的同型二聚体，N端为19〜23个残基组成的信号多肽，染色体定位于2q31o相继发现了IL17家族的其他成员(IL17B〜IL17F),因此最早发现的IL17乂称为IL17A[2]oIL17A/F是Thl7细胞的主要效应分子⑶。Thl细胞主要产生IFN-丫，其效应与IFN-丫及IL-12的作用有关，能调节细胞免疫应答，清除某些细胞内寄生的病原体;Th2细胞

4、产生TI-4.TL-5和TL-13,其效应主要与TL-4的作用有关，介导体液免疫应答和超敏反应,能增强对寄生虫的清除作用。Thl7细胞的发现源于白身免疫病机制的研究。Thl细胞功能失调引起严重炎症反应并诱导产生多种自身免疫病。但是,IFN-r缺陷鼠或IFN-YR缺陷鼠无IFN2Y信号，仍可发生自身免疫病，甚至对自身免疫病更易感。这说明，除产生IFN-丫的Thl细胞外，还有另一Th细胞亚群参与诱导自身免疫病。因这一Th细胞亚群产生1L-17,因此，被命名为Thl7oThl7代表一类不同于Thl或Th2的新的CD4Th细胞亚群，具有很强的促炎症作用，并与多种自身免疫病和肿瘤

5、等疾病的发生和发展有关④役目前国内学者已广泛开展对IL17-A的研究，已有的原核表达，表达产物均为不可溶性表达。但对其单克隆抗体的制备尚未见诸文献。本课题研究TL-17A的原核表达，以及对表达蛋白的活性进行分析，同吋制备TL17-A的单克隆抗体，为TI-17A的深入研究打下基础。第一部分IL17-A基因的克隆及表达1.1主要实验仪器多道可调移液器单道可调移液器八道电动移液器台式高速离心机5415D台式高速冷冻离心机5415R台式高速冷冻离心机5810R大容量冷冻离心机J-25I恒温气浴摇床T0X400.XX2.C细胞破碎仪UP400S摇床KS15A热磁力搅拌器1000超

6、低温冰箱982循环水浴培养箱1013酸度计MP200电子天平BP310S全自动灭菌柜SS-325水平电泳仪垂直电泳槽转移仪德国Eppcndorf公司德国Eppendorf公司徳国Eppendorf公司德国Eppendorf公司德国Eppendorf公司德国Eppendorf公司美国贝克曼公司英国SANYO公司徳国德国美国Jenway公司美国ThermoForma公司徳国GFL公司瑞iMettlerToledo公司北京赛多利斯仪器公司日本T0MY公司美国BIO-RAD美国BI0-RAI)美国BI0-RAD1.2主要实验试剂酸水解酪蛋白、酵母提取物、蛋白腺、胰酶、琼脂糖、低

7、熔点琼脂糖均购于GIBICO公司；澳化乙锭、蔗糖、葡萄糖、甘氨酸、EDTA、聚乙二醇、DAB.疏基乙醇、Tris碱均购于Sigma公司。Rnase＞低分子量蛋白质Marker＞透析袋、过硫酸胺、溶菌酶、澳酚蓝、PMSF、SDS均购于华美生物工程公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠由上海生工生产。无水硫酸镁、DMSO、醋酸钾由北京化工厂生产；甲醇、异丙醇、氯化钠、无水氯化钱、甘油醋酸钠、磷酸二氢钾购于天津市化学试剂批发公司；DL2000DNAMarker.DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自大连宝生物生物基因技术公司；His-tag亲和层析柱均购于