炭疽杆菌芽胞外壁胶原样蛋白基因克隆、表达及其单克隆抗体制备

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1、Y1102371分类号UDC：学校代码密级学位论文炭疽杆菌芽胞外壁胶原样蛋白基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备邵冬冬申请学位级别：硕士专业名称：亟堕簦匿堂论文提交时间：!!!!生!旦论文答辩时间：!!!!生i旦学位授予单位：堑刿盘生学位授予时间：答辩委员会主席：——论文评阅人：盔爱建塾筮盆生型堑塞亟扬州大学兽医学院200七年五月扬州大学硕士学位论文4AmpbpCFUDTTELISAEcoliFITCGSHGSTGSSGHRPIPT0l【DLMmlnmLNCPBSPEGr／rainSDSTSATSBTris-ClX·gal肛g皿符号说明ampicill

2、inbasepaircolony—formingunitDL．DithiothreitolenzymelinkedimmunosorbentassayEsc肠richiacoliFluoresceinisothioeyanateGlutathion(reducedform)Glutathione．，S．transferaseGlutathion(Oxidized)Horseradishperoxidaseisopropyl—B—D—thiogalactosedekilodaltonlitermoleminutemilliliternitrocellul

3、osephosphate—bufferedsalinepolyethyleneglycolrotationperminutesodiumdodecylsulfateTrypticaseSoyAgarTrypticaseSoyBroth嘶shydrochlofide5-bromo-4一ehloro··3·-indolyl-D-D-galactosidemicrogrammicroliter氨苄青霉素碱基对菌集落形成单位二硫苏糖醇酶联免疫吸附试验大肠杆菌异硫氰酸荧光素还原型谷胱甘肽谷胱甘肽一S一转移酶氧化型谷胱甘肽辣根过氧化物酶异丙基硫代．13。D．半乳糖

4、苷干道尔顿升摩尔分钟毫升硝酸纤维膜磷酸盐缓冲液聚乙二醇转／分十二烷基硫酸钠胰酶消化大豆胨肉汤琼脂胰酶消化大豆胨肉汤三(羟)甲基氨基甲烷盐酸盐5．溴．4．氯．B．D．半乳糖糖苷微克微升登奎垄巍垣拄亘羞毽皇E壁匿厘挂重自基固盟夏匡：垂姿丛墓皇直睡蕴佳鲍剑垂!炭疽杆菌芽胞外壁胶原样蛋白基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备研究生：邵冬冬导师：徐建生副教授专业：预防兽医学中文摘要炭疽杆菌是人类历史上第一个被发现的病原菌。炭疽杆菌的研究在近几年取得了较大进展，2003年炭疽杆菌的全基因组序列向全世界发布，意味着炭疽杆菌的研究进入了一个新的发展阶段。炭疽杆菌芽胞外壁

5、胶原样蛋I!I(BclA)是芽胞外壁发状菌丝的主要结构成分，也是芽胞表面的主要免疫原蛋白。从国内分离到的炭疽杆菌中克隆出BclA基因，并将已测序的BclA氨基酸序列与公布的BclA氨基酸序列进行多态性分析，发现不同炭疽杆菌菌株间BelA氨基酸序列存在规律性差异。本研究根据已发表的炭疽杆菌菌株BclA基因序列设计引物，用PCR扩增法从实验室分离的炭疽杆菌菌株MY中扩增出1119bp的BclA基因序列，然后将纯化的PCR产物按正确的阅读框架克隆入pGEX．6p．1载体中的谷胱苷肽．G．转移酶(GsT)基因下游，用IPTG诱导实现其在大肠杆菌中的表达。SDS

6、．PAGE电泳结果显示，表达的融合蛋白约为68kDa。将原核表达产物的蛋白经切胶免疫BALB／c小鼠，并以经谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化后的蛋白作为检测抗原，经过融合、筛选、克隆化获得稳定分泌针对BclA的单克隆抗体细胞系。蛋白转印结果表明此单抗仅与融合蛋白反应，与载体蛋白不反应。关键词：炭疽杆菌；芽胞；BclA；多态性分析；单克隆抗体扬州大学硕士学位论文2Cloning、expressionofBacillusanthracisBclAgeneandpreparationofMonodonalAntibodiesAga面astB

7、clAproteinM．D．Candidate：DDShaoSupervisor：JianshengXuAbstractBacillusanthracis，theaetiologicalagentofanthrax，wasthefirstdiscoveredpathogenicbacteriuminhistoryRapidprogresseshavebeenmadeonthisfieldinrecentyears，especially；Bacillusanthracishasbeensequencedsuccessesfullyin2004andpub

8、lishedontheIntemet．Bacillusanhraciscollagen-lik