人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

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1、人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达【摘要】目的:制备人核迁移蛋白（hNudC)的单克隆抗体（mAb）并鉴定其特性。方法:从人胎肝组织中克隆得到hNudC基因,构建重组表达质粒pET28b/hNudC,表达带有6His标记的重组hNudC,用纯化的重组hNudC蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb,用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆,用免疫荧光染色法及Westernblot试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb

2、的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应,免疫荧光染色和Westernblot试验证明,制备的mAb可以识别人巨核系白血病细胞株Dami、Meg01和人脐带血来源的CD41＋巨核细胞中表达的hNudC蛋白。结论:成功地制备了特异性抗hNudCmAb,为研究hNudC蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。【关键词】人核迁移蛋白;单克隆抗体;巨核细胞人核迁移蛋白C基因(humannucleardistributionC,hNudC),定位于第1号染色体1p34p35,编码331个氨基酸,基因全长为8kb。NudC进化上保守,从构巢曲霉

3、、果蝇、小鼠等生物均能找到同源物,人类NudC羧基末端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%,12与果蝇的同源性为76%,与大鼠的同源性为98%。NudC的C末端12个氨基酸,在所有的种类中都被保留［1］。hNudC在人体组织中广泛表达,提示hNudC具有重要的生物学功能［2］。早期的生物学活性的研究表明,hNudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白、肌动蛋白、LIS1和NUDE)相互作用,和微管一起参与细胞增殖［3］、正常的造血［4］、神经细胞形成等。近期研究进一步证明,hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用［5］。这些资料为hNudC的功能研究提供了新的方向。为了进一步研究h

4、NudC蛋白的结构与功能,探索hNudC对于造血细胞的增殖、分裂的功能和影响,迫切需要hNudC的特异性抗体,但现在并无相应市售抗体。为此,本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原,利用经典的淋巴细胞融合技术,建立稳定分泌特异性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,并对得到的mAb进行鉴定,检测hNudC蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位,为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供工具。1材料和方法1.1材料弗氏完全佐剂购于Sigma公司。蛋白表达载体pET28b(+)购自Invitrogen公司;工具酶购自MBIFermentas公司;质粒DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收

5、试剂盒购自Omega公司;亲和层析柱TALONSpinColumn购自CLONTECH公司;DynalCD3412祖细胞分选系统Prod.No.113.01购自DynalBiotech,Norway公司。造血干细胞无血清培养液StemSpanH2000购自StemCellTechnologies公司;淋巴细胞分离液FicollPaqueTMPlus(1077g/L)购自AmershamBiosciences公司。IMDM(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium)培养基粉末:购自Gibco公司;胎牛血清FBS购自Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigm

6、a公司。FITC标记的CD41mAb、藻红蛋白（PE）标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）、FITC标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）等抗体购自于SouthernBiotechnologyAssociates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大学实验动物中心提供。白血病巨核细胞系Dami、Meg01购自中国科学院上海细胞库。其他化学试剂购自Sigma公司。1.2方法1.2.1外源基因蛋白的表达和纯化将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取单个克隆接种于LB/Kan(50mg/L)培养液中,37℃培养过夜。取上述过夜菌液按比例接种于新鲜的LB/Kan培养

7、液,剧烈振荡,37℃培养2～3h至A600为0.5～0.6,加异丙基硫代BD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5mmol/L,30℃继续继续剧烈振荡培养3h。离心收集菌体沉淀,超声波破碎细胞壁后,常规TALONMetalAffinityResin亲和柱进行蛋白纯化,最后用FPLC12System色谱仪进一步纯化表达产物。电泳鉴定目的蛋白的相对分子质量（Mr）和表达产量。透析过夜,BioRad法测定蛋白质浓度后,-80℃保存备用。1.2.2杂