临床医学毕业论文人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

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1、人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达姓名，2014年6月25日人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达【摘耍】H的：制备人核迂移蛋白(hNudC)的卑克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法：从人胎肝组织中克隆得到hNudC基因，构建重组表达质粒pET28b/hNudC,表达带冇6His标记的重组hNudC,用纯化的重组hNudC蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb，用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆，用免疫荧光染色法及Westernblot试验鉴定mAb的特异性。结果：获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分

2、别为IgGl和IgM(K)，杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1:64和1:32;腹水mAb的效价分别为1:1x105和1:5x104。mAb与重组hNudC蛋白冇较强的特异性反应，免疫荧光染色和Westernblot试验证明，制备的mAb可以识别人巨核系白血病细胞株Dami、Meg01和人脐带血来源的CD41+巨核细胞中表达的hNudC蛋白。结论：成功地制备了特异性抗hNudCmAb，为研究hNudC蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。【关键词】人核迁移蛋白；单克隆抗体；巨核细胞人核it移蛋白C基因(humannucleardistribution

3、C，hNudC),定位于第1号染色体lp34p35,编码331个氨基酸，基因全长为8kl^NudC进化上保守，从构巢曲霉、果蝇、小鼠等生物均能找到同源物，人类NudC羧基末端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%，与果蝇的同源性为76%，与大鼠的同源性为98%oNudC的C末端12个氨基酸，在所有的种类中都被保留［1］。hNudC在人体组织屮广泛表达，提示hNudC具冇重耍的生物学功能［2］。早期的生物学活性的研究表明，hNudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白、肌动蛋白、LIS1和NUDE)相互作用，和微管一起参与细胞増殖［3］、正常的造血［4］、神经细胞形成

4、等。近期研究进一步证明，hNudC在促进造血细胞生长屮起着功能性作用［5］。这些资料为hNudC的功能研究提供了新的方向。为了进一步研究hNudC蛋白的结构与功能，探索hNudC对亍造血细胞的增殖、分裂的功能和影响，迫切需耍hNudC的特异性抗体，但现在并无相应市售抗体。为此，本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原，利用经典的淋巴细胞融合技术，建立稳定分泌特异•性争克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株，并对得到的mAb进行鉴定，检测hNudC蛋白在人巨核细胞巾的表达情况和亚细胞定位，为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供工具。1材料和方法1.1材料弗氏完全佐

5、剂购于Sigma公司。蛋0表达载体pET28b(+)购自Invitrogen公司；：L具酶购自MBIFennentas公质粒DNA捉取试剂盒和涼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购QOmega公司；亲和反析柱TALONSpinColumn购自CLONTECH公司；DynalCD34祖细胞分选系统Prod.No.113.01购自DynalBiotech,Norway公司。造血干细胞无血清培养液StemSpanH2000购自StemCellTechnologies公司；淋巴细胞分离液FicollPaqueTMPlus(1077g/L)购自AmershamBiosciences

6、公口JoIMDM(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium)培养基粉求：购CJGibco公司；胎牛血清FBS购Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigma公司。FITC标记的CD41mAb、藻红蛋白(PE)标记的二抗兔抗鼠IgG(H+L)、FITC标记的二抗兔抗鼠IgG(H+L)等抗体购自于SouthernBiotechnologyAssociates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大学实验动物屮心提供。白血病巨核细胞系Dami、Meg01购S屮W科学院上海细胞库。其他化学试剂购ClSigma公司。1.2方

7、法1.2.1外源基因蛋白的表达和纯化将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单个克隆接种于LB/Kan(50mg/L)培养液中，37°C培养过夜。取上述过夜菌液按比例接种于新鲜的LB/Kan培养液，剧烈振荡，37°C培养2〜3h至A600力0.5〜0.6,加异丙基硫代BD半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，30°C继续继续剧烈振荡培养3h。离心收集茼体沉淀，超声波破碎细胞壁后，常规TALONMetalAffinityResin亲和柱进行蛋白纯化，最•用FPLCSystem色进仪进一步纯化表达产物。电泳鉴定目的蛋白的相对分子质量(Mr)和表

8、达产量。透析过夜，Bio