ercc1的表达纯化及其单克隆抗体的制备

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1、ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备：李晓杰,蒋华,高慧萍,姚晓,石必枝李宗海【摘要】目的:表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体（mAb）。方法:克隆并原核表达ERCC1蛋白,其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果:成功表达了ERCC1蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为37000。获得了1株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株（6F8）,其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测,对应腹水mAb的

2、效价为1∶1.5×106。EM、100mL/L小牛血清,在37℃、50mL/LCO2条件下培养。A431以DMEM、100mL/L胎牛血清,在37℃、50mL/LCO2条件下培养。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自SigmaAldrich。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司。HRP标记的羊抗鼠二抗由本实验室制备。其他试剂均为国产分析纯。BALB/c小鼠由本研究所实验病理室提供。1.2方法1.2.1载体构建及鉴定以人胎盘cDNA为模板,加入针对ERCC1基因的特异引物进行P

3、CR扩增。上游引物ECF为:5′GGAATTCCATATGGACCCTGGGAAGGACAAAGAG3′（划线处为NdeⅠ酶切位点）;下游引物ECR为:5′CCCAAGCTTTCAGGGTACTTTCAAGAAGGGCTCG3′（划线处为HindⅢ酶切位点）。以KODplusDNA聚合酶（ToYoBo）PCR扩增,反应的条件为:94℃3min,然后进行30个循环:94℃30s,58℃30s,68℃50s,最后68℃延伸10min。PCR产物纯化回收,用NdeⅠ和HindⅢ双酶切,同时用NdeⅠ和H

4、indⅢ进行双酶切pET28a(+)载体质粒,在T4DNA连接酶作用下,构建重组表达载体pET28a(+)ERCC1。1.2.2重组ERCC1蛋白的表达及纯化及复性用pET28a(+)ERCC1转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB培养基中,37℃震荡培养过夜,按1∶100转接,37℃培养至A600约为0.6时,加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L,20℃过夜诱导表达。收集菌液,以10000r/min离心10min,弃上清,用含1mmol/LPMSF和1g/L

5、TritonX100的缓冲液A（20mmol/LTRIS、pH7.8、0.5mol/LNaCl）重悬细菌沉淀,经超声破碎细菌后,以12000r/min离心10min。分别取上清和沉淀SDSPAGE电泳确定目的蛋白存在于包涵体中,包涵体经充分洗涤后以缓冲液A（20mmol/LTRIS、pH7.8、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole、8mol/Lurea）溶解。溶解上清采用BioRadDuoFlomolTRIS、pH7.8、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidaz

6、ole）梯度洗脱。收集洗脱峰,100g/LSDSPAGE鉴定纯化效果。将纯化后的蛋白加到透析袋中,以含尿素浓度逐步下降的复性缓冲液（20mmol/LPB,0.1mol/LNaCl,100g/L甘油,0.01mol/L精氨酸,1mmol/L还原性谷胱甘肽,0.5mmol/L氧化性谷胱甘肽pH7.8）,4℃透析。复性缓冲液尿素浓度分别为4、3、2、1、0.5、0.25mol/L尿素缓冲液。每个浓度透析4h以上。最后在大体积的PBS中4℃透析过夜,离心,取上清。1.2.3小鼠免疫及杂交瘤细胞系的建立重组ERCC

7、1抗原用PBS稀释并与等量完全弗氏佐剂混合,充分乳化后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠（50μg/只）。4周后,抗原与等量不完全弗氏佐剂充分乳化,经腹腔注射加强免疫,注射剂量同前。重复加强免疫3次,每次间隔2周。第3次加强1周后,小鼠尾静脉取血,检测抗血清的效价,取效价高的小鼠,脾内注射10μg抗原加强免疫,4d后,取脾细胞与骨髓瘤细胞系Sp2/0在PEG4000作用下融合。1周后,间接ELISA法筛选mAb分泌阳性的杂交瘤细胞。经3～4次有限稀释法克隆化后,选择2株mAb分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培

8、养。1.2.4抗体制备及纯化BALB/c小鼠预先腹腔注射0.5mL液体石蜡,1周后,每只小鼠腹腔注射2×105相应杂交瘤细胞,约1周后,收集小鼠腹水。以硫酸铵差级沉淀法纯化抗体。1.2.5ELISA测定效价采用间接ELISA法。用ERCC1蛋白（1mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本,二抗为1∶2000的HRP羊抗鼠IgG,经ABTS底物显色后,于波长405测定A值。1.2.6