ercc1的表达纯化及其单克隆抗体的制备

《ercc1的表达纯化及其单克隆抗体的制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备作者：李晓杰,蒋华,高慧萍,姚晓,石必枝李宗海【摘要】目的:表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体（mAb）。方法:克隆并原核表达ERCC1蛋白,其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果:成功表达了ERCC1蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为37000。获得了1株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株（6F8）,其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测,对应腹水mAb的效价为1∶1.5×106。Westernblot结果显

2、示抗ERCC1mAb具有良好的特异性。结论:成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1mAb。【关键词】ERCC1;原核表达;纯化;单克隆抗体核苷酸切除修复（nucleotideexcisionrepair,NER）是哺乳动物细胞DNA修复的主要途径;切除修复交叉互补基因（excisionrepaircrosscomplementing1,ERCC1）在核苷酸切除修复过程中起着关键作用。最近,很多研究表明它的表达与肺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤对铂类药物的敏感性有密切关系［1-3］,其表达有望作为铂类用药的分子标记。但是迄今为止,国内尚无制备其单克隆抗体(m

3、Ab)的报道。我们在本研究中表达纯化了ERCC1蛋白并制备了其mAb,8为将来检测ERCC1奠定基础。1材料和方法1.1材料pET28a(+)载体、大肠杆菌BL21（DE3）、骨髓细胞系Sp2/0、A431细胞系由本实验室保存。骨髓细胞系Sp2/0以DMEM、100mL/L小牛血清,在37℃、50mL/LCO2条件下培养。A431以DMEM、100mL/L胎牛血清,在37℃、50mL/LCO2条件下培养。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自SigmaAldrich。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司。HRP标记的羊抗鼠二抗由本实

4、验室制备。其他试剂均为国产分析纯。BALB/c小鼠由本研究所实验病理室提供。1.2方法1.2.1载体构建及鉴定以人胎盘cDNA为模板,加入针对ERCC1基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物ECF为:5′GGAATTCCATATGGACCCTGGGAAGGACAAAGAG3′（划线处为NdeⅠ酶切位点）;下游引物ECR为:5′CCCAAGCTTTCAGGGTACTTTCAAGAAGGGCTCG3′（划线处为HindⅢ酶切位点）。以KODplusDNA聚合酶（ToYoBo）PCR扩增,反应的条件为:94℃3min,然后进行30个循环:94℃30s,58℃3

5、0s,68℃50s,最后68℃8延伸10min。PCR产物纯化回收,用NdeⅠ和HindⅢ双酶切,同时用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切pET28a(+)载体质粒,在T4DNA连接酶作用下,构建重组表达载体pET28a(+)ERCC1。1.2.2重组ERCC1蛋白的表达及纯化及复性用pET28a(+)ERCC1转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB培养基中,37℃震荡培养过夜,按1∶100转接,37℃培养至A600约为0.6时,加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L,20℃过夜诱导表达。收集菌液,以10000r/min离

6、心10min,弃上清,用含1mmol/LPMSF和1g/LTritonX100的缓冲液A（20mmol/LTRIS、pH7.8、0.5mol/LNaCl）重悬细菌沉淀,经超声破碎细菌后,以12000r/min离心10min。分别取上清和沉淀SDSPAGE电泳确定目的蛋白存在于包涵体中,包涵体经充分洗涤后以缓冲液A（20mmol/LTRIS、pH7.8、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole、8mol/Lurea）溶解。溶解上清采用BioRadDuoFlow层析系统,进行NiNTAHisBind亲和柱层析,缓冲液B（20mmolTR

7、IS、pH7.8、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰,100g/LSDSPAGE鉴定纯化效果。将纯化后的蛋白加到透析袋中,以含尿素浓度逐步下降的复性缓冲液（20mmol/LPB,0.1mol/LNaCl,100g/L甘油,0.01mol/L精氨酸,1mmol/L还原性谷胱甘肽,0.5mmol/L氧化性谷胱甘肽pH7.8）,4℃透析。复性缓冲液尿素浓度分别为4、3、2、1、0.5、0.25mol/L尿素缓冲液。每个浓度透析48h以上。最后在大体积的PBS中4℃透析过夜,离心,取上清。1.2.3小鼠免疫及杂交瘤细胞系的

8、建立重组E