ERCC1表达纯化及其单克隆抗体制备

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1、ERCC1表达纯化及其单克隆抗体制备作者：李晓杰，蒋华，高慧萍，姚晓，石必枝李宗海【摘要】目的：表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体(mAb)。方法：克隆并原核表达ERCC1蛋白，其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠，经融合、筛选制备特异性mAbo结果：成功表达了ERCC1蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为37000o获得了1株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株(6F8),其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b。ELISA检测，对应腹水mAb的效价为1：1.5X10

2、6oWesternblot结果显示抗ERCC1mAb具有良好的特异性。结论：成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1mAbo【关键词】ERCC1；原核表达；纯化；单克隆抗体核昔酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)是哺乳动物细胞DNA修复的主要途径；切除修复交叉互补基因(excisionrepaircrosscomplementing1,ERCC1)在核昔酸切除修复过程中起着关键作用。最近，很多研究表明它的表达与肺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤对铀类药物的敏感性有密切关系[1-3],其表达

3、有望作为钳类用药的分子标记。但是迄今为止，国内尚无制备其单克隆抗体(mAb)的报道。我们在本研究中表达纯化了ERCC1蛋白并制备了其mAb,为将来检测ERCC1奠定基础。1材料和方法1.1材料pET28a(+)载体、大肠杆菌BL21(DE3).骨髓细胞系Sp2/0、A431细胞系由本实验室保存。骨髓细胞系Sp2/0以DMEM、100mL/L小牛血清，在37°C、50mL/LC02条件下培养。A431以DMEM、100mL/L胎牛血清，在37°C、50mL/LC02条件下培养。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自SigmaAldric

4、ho胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司。HRP标记的羊抗鼠二抗由本实验室制备。其他试剂均为国产分析纯。BALB/c小鼠由本研究所实验病理室提供。1.2方法1.2.1载体构建及鉴定以人胎盘cDNA为模板，加入针对ERCC1基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物ECF为:5'GGAATTCCATATGGACCCTGGGAAGGACAAAGAG3'（划线处为NdeI酶切位点）；下游引物ECR为：5'CCCAAGCTTTCAGGGTACTTTCAAGAAGGGCTCG3'（划线处为HindI

5、II酶切位点)。以KODplusDNA聚合酶(ToYoBo)PCR扩增，反应的条件为：94£3111让，然后进行30个循环:94°C30s,58°C30s,68°C50s,最后68°C延伸10minoPCR产物纯化回收，用Ndel和HindIII双酶切，同时用NdeI和HindIII进行双酶切pET28a(+)载体质粒，在T4DNA连接酶作用下，构建重组表达载体pET28a(+)ERCClo1.2.2重组ERCC1蛋白的表达及纯化及复性用pET28a(+)ERCCl转化大肠杆菌BL21(DE3)O挑取单克隆接种于含50mg/

6、L卡那霉素的LB培养基中，37£震荡培养过夜，按1：100转接，37。(2培养至A600约为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L,2(TC过夜诱导表达。收集菌液，以10000r/min离心10min,弃上清，用含1mmol/LPMSF和1g/LTritonX100的缓冲液A(20mmol/LTRIS、pH7.8、0.5mol/LNaCl)重悬细菌沉淀，经超声破碎细菌后，以12000r/min离心10min。分别取上清和沉淀SDSPAGE电泳确定目的蛋白存在于包涵体中，包涵体经充分洗涤后以缓冲液A(20mmol/

7、LTRIS.pH7・8、0.5mol/LNaCl0.5mol/Limidazole、8mol/Lurea)溶解。溶解上清采用BioRadDuoFlow层析系统，进行NiNTAHisBind亲和柱层析，缓冲液B(20mmolTRIS、pH7・8、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole)梯度洗脱。收集洗脱峰，100g/LSDSPAGE鉴定纯化效果。将纯化后的蛋白加到透析袋中，以含尿素浓度逐步下降的复性缓冲液(20mmol/LPB,0.1mol/LNaCl,100g/L甘油，0.01mol/L精氨酸，1mmo

8、l/L还原性谷胱甘肽,0.5mmol/L氧化性谷胱甘肽pH7.8),透析。复性缓冲液尿素浓度分别为4、3、2、1、0.5、0.25mol/L尿素缓冲液。每个浓度透析4h以上。最后在大体积的PBS中4。（2透析过夜，离心，取上清。1.2.3小鼠免疫及杂交瘤细胞系的建立重组ERCC1抗原用PB