多酚氧化酶特性研究

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1、多酚氧化酶特性研究摘要：采用分光光度法，对板栗仁多酚氧化晦（PPO）的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH值、热稳定性等性质进行了研究，同时研究了Vc、EDTA、NaCl.柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明：板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm,最佳反应时间为3min,最适反应温度为30°C,最适pH值为6.0,米氏常数Km=0.0694mo1/L,Vmax=3.9180I）/mino95°C水浴处理5min该酶己基本失活，其屮Vc和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。关键词：板栗；多酚氧化

2、酶；褐变;抑制多酚氧化酶（Polyphenoloxidase,PPO）是由核基因编码的铜金属酶，其酶促褐变机制是：内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成幅，幅再相互作用生成高分子聚合物，从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应，可以使一元酚轻基化，生成相应的邻二魁基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成幅［l］o而酚类物质是果疏纽.织褐变的物质基础，不同植物、同一植物的不同组织，同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期，其褐变的主要酚类物质均有所不同，导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗，但对板栗仁PPO的活性及影响活性因索的研究则未见报道。1材料与方法

3、1.1材料板栗市场购外观良好，无病虫害，无机械损伤新鲜的云南板栗。1.2试剂与仪器主要试剂：聚乙烯毗咯烷酮（PVPP）、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C（Vc）、EDTA.柠檬酸、氯化钠等，均为国产分析纯。主要试验仪器：TGL-16G高速台式冷冻离心机、722W型分光光度计、HH-4型数显恒温水浴锅、冰箱等。1.3试验方法1.3.1粗酶液的制备酶液提取参照文献［2］的方法，有所改进。称150g冷冻鲜样，加入PH值6.0的0.05mol/L冷冻磷酸缓冲液150mL和15gPVPP,打浆，过滤，于3°C下12000r/m

4、in离心15min,取上清液置于0~4°C保存备用。1.3.2褐变度（BD）的检测称5g样品加入15mL蒸憾水中研磨，离心（14000r/min>15min）0沉淀溶于15mL甲醇甲酸溶液（休积比1:1）,充分浸提15min后离心。将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL,离心，取上清液检测410nm下的吸光值AnX10表示。1.3.3总酚（TP）的提取和含量检测称取5g样品，加入15n）L乙醛-盐酸溶液（pII3.0）研磨，在恒温水浴中震荡lh,取出离心15000r/min,30min,量取滤液体积，吸取5mL,用蒸水定容到50mL,测定A值，用邻苯二酚做

5、标准曲线。1.3.4酶活性的测定取2n±0.2mol/L邻苯二酚溶液和2mL—定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管屮，然后加入0・5］讥的粗酶液，水浴保温3min后立即倒人比色管屮，在410nni波长处测定反应混合液的吸光值变化（AA）,每30s读数1次，共记录3mino空白用蒸馆水代替邻苯二酚。酶活性以IminAA值为每增加0.001为1个活力单位(U)o检测410nm下的吸光值表示为A=UX100o1结果与分析1.1工作波长的选择体系反应产物在可见光波350~470nm下的吸光度见图1所示。毘1.4次1.2渓10.80.60.40.23503703904104

6、30450470—♦—A:3min—■B:6minC:9minD:12min—米—E:15min波长PP0酶促反应体系每隔3min的波长扫描图。由图1可以看出在从350nm后吸光值一直呈下降的趋势，但当反应液在410nm处时吸光度值便出现上升，并从最初3niin的约0.527升到9min的约0.63&随着时间的延长反应液在410nm处的吸光度值逐渐增人。当反应15min后吸光度值已经增大到接近0.87,并形成一个大的波峰，说明该晦促反应的产物最大吸收波K在410nm处，故以此波长处的吸光度来衡量PPO酶促反应速度的人小。2.2PPO的活性测定以1.3.4中所述

7、的方法进行PPO活性的测定，其结果见图2所示：在5min内，随着时间的延长吸光值也随之增人，在反应达3min时吸光度的变化达到最人，此后增长趋于平稳。因此试验的测定均采用反应3min时410mn处的0D值表示PPO的活力。时间(S)图2ppo反应进程曲线2.3总酚含量与褐变度的关系按照1.3.3中总酚测定方法测定，以邻苯二酚浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，总酚标准工作曲线见图3。0.30.250.20.150」0.05000.00.00.00.00.10.1总酚含量工作标准曲线由于吸光值越大说明褐变越厉害,出图3可以看出，总酚含量与褐变度的关系为直接相关，而相关

8、系数很大(R2=0.9692),说明总