蜜柚多酚氧化酶的酶学特性与活性测定研究

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1、北方园艺２０１０（１７）：１７１～１７４·生物技术·蜜柚多酚氧化酶的酶学特性与活性测定研究纪淑娟１，尹竞男１，２，李家政２（１．沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳１１０１６１；２．国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津３００３８４）摘要：以邻苯二酚为底物，采用分光光度法在４２０ｎｍ处测定蜜柚多酚氧化酶（ＰＰＯ）的活性，研究底物浓度、ｐＨ、温度及酶液浓度对ＰＰＯ活性的影响，并建立了酶促褐变反应动力学方程。结果表明：蜜柚多酚氧化酶的酶促反应符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学，

2、以邻苯二酚为底物的最大反应速度为：Ｖｍａｘ＝２２．４５２Ｕ／ｍｉｎ，Ｋｍ＝１２８．２ｍｍｏｌ／Ｌ。蜜柚多酚氧化酶作用的最适ｐＨ６．４，最适温度为１０℃。不同时间的蜜柚多酚氧化酶的平均活性呈逐渐下降的趋势。关键词：蜜柚；多酚氧化酶；酶学特性；测定中图分类号：Ｓ６６６．３文献标识码：Ａ文章编号：１００１－０００９（２０１０）１７－０１７１－０４［１－２］褐变是果蔬采后重要的生理变化现象，并直接取液。影响着果蔬贮藏的品质和商品价值。果蔬采后的褐变１．２．２ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１［３－５］主要是多

3、酚氧化酶（ＰＰＯ）引起的。多酚氧化酶是一ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加类含Ｃｕ元素的膜结合蛋白，它催化果蔬体内的多酚类入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变物质氧化形成醌，后者自身缩合或与细胞内蛋白质结化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液合，形成褐色或黑色物质。多酚氧化酶活性测定已成为的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个［６－８］采后果蔬生理研究的重要内容。但不同植物的多酚ＰＰＯ酶活性单位。［９－１２］氧化酶的酶学特性差异很大，因而对测定方法

4、的要１．２．３底物浓度对ＰＰＯ活性的影响在室温（１８℃）下求也有所不同。课题组研究初步表明，蜜柚在贮藏后期将ｐＨ６．４的磷酸缓冲液４ｍＬ加入１ｍＬ邻苯二酚（浓具有较高的多酚氧化酶活性，并与果肉颜色变暗有直接度分别为０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１Ｍ）中，按１．２．２的的联系（待发表）。但蜜柚多酚氧化酶的酶学特性研究方法测定不同底物浓度下的ＰＰＯ活性。尚未见文献报道。该试验对蜜柚多酚氧化酶的基本酶１．２．４ＰＰＯ最适ｐＨ配制不同ｐＨ的磷酸氢二钠－学特性进行研究，并确定其最佳测定方法。磷酸二氢钠缓冲液，

5、取酶液１ｍＬ、０．１Ｍ邻苯二酚１ｍＬ１材料与方法分别加入不同ｐＨ的磷酸缓冲液４ｍＬ，立即在４２０ｎｍ１．１试验材料下测定吸光度值。以不同ｐＨ但不加酶提取液的反应液蜜柚：购于超市的鲜果，产地为福建漳州。果体大做对照，测定方法同上。小均匀，色泽一直，外观良好，无机械外伤。邻苯二酚、１．２．５ＰＰＯ最适反应温度和对温度的稳定性参照段［１０］磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸：均为分析纯。玉权等的方法，将０．１Ｍ的邻苯二酚１ｍＬ、ｐＨ６．４１．２试验方法的磷酸缓冲液４ｍＬ和酶提取液１ｍＬ混合，在不同温度１．２．１ＰＰＯ的提

6、取取１ｇ蜜柚果肉样品，冰浴研磨，水浴（０～９０℃，间隔为１０℃）中分别保温１０ｍｉｎ后，加三加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心氯乙酸终止反应，反应液冷却至室温，在４２０ｎｍ处测定（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提吸光度值。对温度的稳定性测定是将０．１Ｍ的邻苯二酚１ｍＬ、ｐＨ６．４的磷酸缓冲液４ｍＬ混合液分别在第一作者简介：纪淑娟（１９６０－），女，博士，教授，现主要从事食品质８０℃、９０℃水浴中分别保温５、１０、２０ｍｉｎ，将反应液迅速量控制教学和研究工作。冷却至

7、室温，加入酶提取液１ｍＬ，参照１．２．２的方法测通讯作者：李家政（１９６５－），男，博士，副研究员，现主要从事果蔬保定残余酶的吸光度值变化。鲜技术研究与开发。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｊｚｈ１６３＠１６３．ｃｏｍ。１．２．６不同ＰＰＯ浓度下的平均酶活性的测定在室温基金项目：科技部“十一五”科技支撑计划重点资助项目（１８℃）、ｐＨ６．４条件下测定不同酶液浓度时产物吸光度（２００６ＢＡＤ３００１）。随时间的变化。分别在４．９、４．８、４．６、４．４、４．２和４．０ｍＬ收稿日期：２０１０－０５－０７磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中加

8、入１ｍＬ０．１Ｍ的邻苯二酚，１７１·生物技术·北方园艺２０１０（１７）：１７１～１７４再分别加入０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍＬ酶提取液，于图（图２），从图中直线的斜率和其在纵坐标上的截距可不同反应时间测定波长４２０ｎｍ下吸光度值。酶平均活求得Ｋｍ为１２８．２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ２２．４５２Ｕ／ｍｉｎ。米氏常性为测定时间内产物吸光度的平均变化率，以平均