第二章 分子克隆的工具酶

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1、第二章分子克隆的工具酶Enzymeusedinmolecularcloning1限制性核酸内切酶3DNA连接酶4DNA聚合酶5核酸酶6核酸修饰酶2甲基化酶123第一节限制性核酸内切酶一、限制与修饰1.限制与修饰现象噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。4细菌的限制与修饰现象大肠杆菌C100%100%100%100%5K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA。10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA。6限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。E.coliB含有EcoB核

2、酸内切酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。72.限制性核酸内切酶的发现二十世纪60年代，提出限制性酶切和限制酶的概念1968年,首次从E.coli.K中分离到限制性内切酶需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点离识别位点达1000bp以上1970年，Smith等人首先从流感

3、嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII83.限制性内切酶的生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵94.限制性核酸内切酶的命名命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。前三个字母用斜体表示。宿主：属名第一个字母，大写；种名头两个字母，小写菌株名或生物型号：小写;序号：用罗马字表示，指同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EcoRI:来

4、自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶10限制性核酸内切酶的命名属名种名菌株名HindIIIHaemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株流感嗜血杆菌d株里的第三个限制性核酸内切酶11早前，一般在限制酶名称前加R修饰酶名称前加M且菌株号和序号小写现在限制酶名称前不加R修饰酶名称前仍加M序号为大写12依据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子分类5.限制与修饰系统的种类可分为三类：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ也有分四类：Ⅱs即Ⅱ亚类13识别回文对称序列(Palindromicsequence)，在回文序列内部或附近切割DNAⅡ型（typeⅡ）93%需Mg2+，相应的修饰

5、酶只需SAM识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列产生带3’-OH和5’-PO4基团的DNA产物但有少数酶识别更长的序列或简并序列(Degeneratesequence)，切割位置因酶而异，有些是隔开的。1415Ⅱ型（typeⅡ）93%Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体(monomer)，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。16与Ⅱ型具有相似的辅因子要求Ⅱs型（typeⅡ）5%识别位点：非对称、非间

6、断长度为4-7bp切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内17种类很少如EcoK和EcoBⅠ型（typeⅠ）1%限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoKR2M2SEcoBR2M4S2切割位点在识别位点1000bp以外，无特异性1819种类更少，如EcoP1和EcoP15。识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处。Ⅲ型（typeⅢ）＜1%20ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶辅助因子M

7、g2+ATPMg2+SAMATPMg2+SAM识别位点4-6bp,大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点特异性切割至少在识别位点外1000bp随机性切割在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应相互排斥同时竞争限制作用是否需用ATPNoYesYes各种限制与修饰系统的比较21表2-2：各种限制与修饰系统的比较DNA限制性内切酶定义：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶