分子生物学（中文）5分子生物学基本研究法

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1、第五章分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工

2、程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。Generalizedmodelofsemiconservativereplicationof

3、DNA.Newsynthesisisshowninblue.三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。中心法则的演变1954年首次提出的“中心法则”1970-1980年的“中心法则”21世纪后修正的“中心法则”上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1

4、972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。WernerArber,HamiltonSmithandDanielNathanswereawardedthe1978NobelPrizefortheirworkonREs.图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体RE切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096bp核DNA有一个酶切位点（46），而一

5、个4碱基切割酶平均每256bp核DNA就有一个酶切位点（44）。重组DNA实验中常见的主要工具酶酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚或单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌

6、体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链末端的磷酸基团嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤嘧啶胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶组成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程单核苷酸5‘-磷酸基团向核酸链的3’-OH发起进攻（二）基因克隆的载体载体三要素：自我复制能力携带外源基因片段大小插入位点多少易于鉴定识别程度大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位

7、点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000

8、个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成