分子生物学研究法

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1、分子生物学研究法（上）DNA基本操作技术1.核酸凝胶电泳技术电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做迁移率；电场强度越大,电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移速度越快。其无反应活性的稳定的支持介质有琼脂糖.聚丙烯酰胺等。电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。表5-2琼脂疇及R丙分購DNA片段的能力芨胶娄聖及浓度分屬DNA片段的大小范fR/bp0.3%琼脂箱50000-10000.7%琼脂糖20000-10001.4%琼脂糖6000-3004.0%聚丙烯脱胺1000-10010.0%聚内烯醜胺500-2：520.0%«丙烯酰胺

2、50-1在凝胶电泳中,加入适磧漠乙呢(ethidiumbromide,EB)染料对孩酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外线F观察■可卜分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位■即使每条DNA带中仅含仃0.05啓的微愦DNA.也可以被淸晰地检测出来涣乙喘兄一种具眉平分产的孩酸染料.能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间.并在300run波长的紫外线照射下发出荧比c把含冇DNA分子的凝胶浸泡在溪乙锭的溶液中，或是将棋乙喘伍接加到DNA的凝胶介质中■此种染料便会在一切可能的部位与DNA分子结合■然而却不能与琼脂糖

3、凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合■因此■只有dnA分F能吸收浪乙咙并发出荧比°在适卅的染色条件下•荧光强度与DNA片段的大小(或数塑)成正比。实验表明•用普通琼脂糖凝胶电泳■很难分离大于50好＞的DNA分子•为了进行超大片段DNA研究■科学家发明了脉冲电场擬胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis.PFGE)技术.用于分离超大相时分f质猷(有时甚至是整条染色体)DNA。在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向葩拧电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中.第一个脉冲的电场方向与孩酸移动方向成45

4、。夹角■而第二个脉冲的电场方向与孩酸移动方向住列一侧成45。夹角(国「4)由十琼脂辦凝胶的电场方向.电流大小及作用时间都在交替i变换■使彳yDNA分f与相对分子质蚩较能够随时閘整氏游动方向■以适应凝胶孔隙的无规则变化。小的DNA相比•相对分子质戢絞大的DNA需耍更多的脉冲次数来更换共构型和方位•使其按新的方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功地分离到相对分子质凰高达107bp的1)NA大分子

5、2、细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化(transformation,是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导

6、致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。在基因克隆的过程中，我们通常要通过细菌转化将体外构建好的杂种DNA分子导人宿主细胞中。进人宿主细胞的外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，使其能够在宿主细胞中保持下来，并且还能够很容易地以完整的形式从细胞中被分离纯化岀来。绝大多数细菌，包括大肠杆菌(E.coli),正常条件下仅能获取极少量的DNAo为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学处理，以增加它们获取DNA的能力。经历了这种处理的细

7、胞被称作感受态细胞(compe-tentcells)o细菌转化常用的方法有CaCI2法和电击法。CaCI2法是制备大肠杆菌感受态最常用的化学方法。将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0C）预处理的低渗CaCI2溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。此时,将该体系转移到429C下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。进人细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分

8、子的阳性克隆。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5X10%-2xW个转化子/ug超螺旋质粒DNA（图5-5）o电击法是细菌转化的另一种高效方法。锐利的电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，并由此形成纳米级疏水孔洞。随着跨膜电压增加，一些较大的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞。在孔洞开放的时候，介质中的DNA很容易通过孔洞进人细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4C后离心，用相同温度的纯水洗涂，用10%的甘油悬浮后将高密度菌^e2x10VmL）E于特制的电极杯中进行电击。获得最大转化效率时场强一般为1

9、2.5-15kV/em,时间跨度一般为4.5~5.5mso电击转化与温度有关，最好在0~4C进行。由于转化载体上一般带有LacZ基因，实验室常用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨节西林、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合a■互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。空铁2限制性内切M含勺卄谭DNA的戟体5牍勺嵋*体包&无关的DNA片讯的成