分子生物学研究法上

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1、第五章分子生物学基本研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达

2、。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的重大事件（三大成就）：一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者（即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题）；二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。5.1基因操作的基本工具5.2DNA操作技术5.3RNA基本操作

3、技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆（clone）技术5.6蛋白质与蛋白质组学技术（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端（不是整齐地切开，即在两条链上的切开位点不对称）的小片段。5.1基因操作的基本工具图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点（二）基因克隆的载体基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源

4、的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子。在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节:目的基因和载体的获得;目的基因与载体连接,形成重组分子;重组DNA分子导入宿主细胞;含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增；基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。基因克隆载体的三要素：自我复制能力；携带外源基因片段大小；插入位点多少；易于鉴定识别程度。大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，

5、平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制（在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有1—2个/每染色体。）的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量

6、很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核

7、细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。5.2DNA操作技术一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离

8、子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链D